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禽副粘病毒4型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

型    号:50次
所属分类:PCR-染料法
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禽副粘病毒4型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒荧光定量是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。

禽副粘病毒4型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒产品概述:

禽副粘病毒4型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

Avian Paramyxovirus 4(APMV)

产品及特点

禽副粘病毒(Avian Paramyxovirus,APMV)主要危害鸡、珠鸡和火鸡,在 被侵袭的鸡群中迅速传播,强毒株可使鸡群全群毁灭。弱毒株仅引起鸡群呼吸道 感染和产蛋量下降,但可迅速康复。人类可因接触病禽和活毒疫苗而引起结膜炎 或淋巴腺炎,因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。禽副粘病毒含有多种血 清型。本产品以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测禽副粘病毒 4 型的试剂盒,它具有下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供样品 RNA 模板。

2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。

3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4. 特异性高,引物是根据禽副粘病毒 4 型高度保守区设计,不会跟其他病毒的 RNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

禽副粘病毒4型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分

编号

成分

规格

试剂一

探针法 qRT-PCR 缓冲液

500 μL(蓝盖) 

试剂二

探针法 qRT-PCR 酶混合液

100 μL(红盖) 

试剂三

荧光 PCR 模板稀释液

1 mL(黄盖)

试剂四

禽副粘病毒 4 型探针法 qRT-PCR 引物混 合液 

100 μL白盖) 

试剂五 禽副粘病毒 4 型qRT-PCR 探针  50 μL(棕色管)
试剂六 禽副粘病毒 4 型探针法 qRT-PCR 阳性对 照(1×10E8 拷贝/μL) 50 μL(黄盖)

试剂七

使用手册

1 份

运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。 

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 模板稀释液,用带芯枪 头,下同)。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7. 如果有 N 个样品,设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂 盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后后加): 

成分

样品管 N+2 个

PCR 阴性 对照管

标准曲线 样品管(2-7 管)

探针法 qRT-PCR 缓冲液

10 μL

10 μL

10 μL

探针法 qRT-PCR 酶混合液

2 μL

2 μL

2 μL

 禽副粘病毒 4 型 qRT-PCR 探针各 1 μL 1 μL 各 1 μL

禽副粘病毒 4 型探针法 qRT-PCR 引 物混合液

 各 2 μL

 2 μL

各 2 μL

 待测样品 RNA 模板 各 5 μL  
超纯水  5 μL 
 第 7 步所得标准曲线样品稀释液 (2-7 号)   各 5 μL(2 号 样到 2 号管, 3 号样到 3 号 管…)

11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 qRT-PCR:

过程

温度

时间

逆转录

50℃

30 min

 预变性 94℃ 10 min

 

qRT-PCR 反应 (40 个循环)

94℃ 

15 sec

60℃

1 min(采集 FAM 通道的荧光信号)

 

五、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。

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