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小鼠白介素6(IL-6)检测试剂盒

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所属分类:小鼠ELISA试剂盒
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小鼠白介素6(IL-6)检测试剂盒一种多功能细胞因子,在体内免疫反应调节、血细胞的增生、防御机制和急性期反应中起中心作用。既可由淋巴细胞产生,也能由非淋巴细胞合成,如单核/巨噬细胞,纤维母细胞,肝细胞,角化细胞,星形细胞,血管内皮细胞和各种肿瘤细胞。IL-6的合成受多种细胞因子、核分裂因子和抗原的刺激而增加。

小鼠白介素6(IL-6)检测试剂盒产品概述:

小鼠白介素6(IL-6)检测试剂盒

检测范围:15.6pg/ml→1000pg/ml。
特异性:系统和其它细胞因子无交叉反应。
敏感性:<1pg/ml
保存:2-8℃(频繁使用时);-20℃(长时间不用时)。
有效期:6个月(4℃);12个月(-20℃)。
用途:用于体外定量分析小鼠血清、血浆、细胞培养上清、细胞裂解液

Interleukin-6,IL-6,白介素-6。IL-6是一种多功能细胞因子,在体内免疫反应调节、血细胞的增生、防御机制和急性期反应中起中心作用。既可由淋巴细胞产生,也能由非淋巴细胞合成,如单核/巨噬细胞,纤维母细胞,肝细胞,角化细胞,星形细胞,血管内皮细胞和各种肿瘤细胞。IL-6的合成受多种细胞因子、核分裂因子和抗原的刺激而增加。IL-6是一种糖蛋白,包含N-和O-连碳水化合物,分子量21KD-28KD。其糖蛋白成份并非功能所必须。本试剂盒所用的标准品为重组IL-6,有188个氨基酸。分子量21.8KDa。

所提供的IL-6 ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA)。预先包被的抗体为单克隆抗体,克隆号MP520F3。检测相抗体为多克隆抗体,经生物素(biotin)标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后,PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应;经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-6呈正相关。

试剂盒组成:

组分规格数量
预包被抗小鼠IL-6抗体的96孔板96T1板
重组小鼠IL-6冻干标准品10ng/管2管
生物素标记抗小鼠IL-6(100X)130μL1管
亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)(100X)130μL1管
样品稀释液30ml1瓶
抗体稀释液12ml1瓶
ABC稀释液12ml1瓶
TMB显色液10ml1瓶
TMB终止液10ml1瓶
洗涤缓冲液(25X)20ml1瓶
封板膜 4张



需要而未提供的试剂和器材:
1.标准规格酶标仪。
2.自动洗板机。
3.恒温箱
4.系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,用多通道移液器。
5.干净的试管和Eppendof管。
6.用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍,成1X洗涤缓冲液。

注意事项:
1.使用前TMB显色液应为无色透明溶液,若发现颜色异常,请及时与厂家联系。
2.用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
3要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
4.为免交叉污染,要避免重复使用手中的吸头和试管。
5.禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
6.本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板,用户可按需求使用;剩余的酶标板请按保存条件贮存。
7.揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

洗板方法:
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将1X洗涤缓冲液至少300μL注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品的准备和保存:
样品如果不立即分析,应分装后冷冻保存,且避免反复冻融。
细胞培养上清——离心去除沉淀,立即分析或分装后-20℃冷冻保存
血浆——采用肝素、EDTA或柠檬酸盐抗凝,抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血清——用干净试管收集血液,室温凝固30分钟,离心2000×g 20分钟,收集血清。标本立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞裂解液——对于贴壁细胞,去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液,用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后,细胞就会被裂解。对于悬浮细胞,离心收集细胞,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液,用枪吹打把细胞吹散,用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后,10000—14000g离心3-5分钟,取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

样品稀释的一般原则:
用户须估计样品待测因子的含量,决定适当的稀释倍数,以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同,分别采取不同的稀释方案:
高——指待测因子在10-100ng/ml。一般按1:100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
中——指待测因子在1-10ng/ml。一般按1:10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
低——指待测因子在15.6-1000pg/ml。按1:2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
特低——指待测因子≤15.6pg/ml。样品一般不做稀释,或按1:2稀释。
以上方案仅供参考,样品的稀释应有详细记录。

试剂的准备和保存:
A.IL-6标准品的稀释和使用。
试剂盒提供2管标准品,每管10ng,每次使用1管。
1.配制10,000pg/ml标准品:取1ml样品稀释液加入标准品管内,盖好后静置10分钟以上,然后颠倒/搓动以助溶解。
2.配制1000pg/ml标准品:取100μL10,000pg/ml的标准品加入有0.9ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀,做上标记。
3.配制500pg/ml→15.6pg/ml标准品:准备6只Eppendorf管,每管加0.3ml样品稀释液,分别标记上500pg/ml,250pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml,31.3pg/ml,15.6pg/ml。取0.3ml 1000pg/ml的标准品加入标记500pg/ml的管中,混匀后同样取出0.3ml,加入下一只管中。余同此类推,直到后一只样品管。
注意:已经稀释的标准品(10,000pg/ml),应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下,2天内可以使用,但不得反复冻融。
B.生物素标记抗小鼠IL-6抗体工作液:在使用前2小时内准备。
1.根据每孔需要100μL计算总的用量(实际配制时应多配制100-200μL)。
2.按1μL生物素标记抗小鼠IL-6加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
C.亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备:在使用前1小时内准备。
1.根据每孔需要100μL计算总的用量(实配时应多配制100-200μL)。
2.按1μL亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。

操作步骤:
已稀释好的ABC 和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时,切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量,决定适当的稀释倍数。
1.确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目,并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9;做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。
2.将1000pg/ml,500pg/ml,250pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml,31.3pg/ml,15.6pg/ml的标准品各100μL依次加入一排7孔中,1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于小鼠血清、血浆、细胞培养上清、细胞裂解液,直接加已用样品稀释液稀释的样品100μL。
3.酶标板加上封板膜,37℃反应90分钟。
4.反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体;或甩去酶标板内液体,再对着吸水纸拍几下。不洗。
5.将准备好的生物素抗小鼠IL-6抗体工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。酶标板加上封板膜,37℃反应60分钟。
6.1X洗涤缓冲液洗涤3次,每次浸泡1分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
7.将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入(TMB空白显色孔除外)。酶标板加上封板膜,37℃反应30分钟。
8.1X洗涤缓冲液洗涤5次,每次浸泡1-2分钟左右(每孔洗液至少300μL)。
9.按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液,37℃避光反应20-25分钟(注意:显色时间供参考,因用户实验室条件差异,显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔差别不明显)。
10.按每孔100μL依次加入TMB终止液,此时蓝色立转黄色。
11.用酶标仪在450nm测定O.D.值。
有两种设定空白对照的方案:
(1)将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后,在坐标纸上画出曲线,以吸光值作为纵坐标,以浓度作为横坐标。
(2)将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后,得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
12.根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍,其实际浓度应该×N。

操作步骤总结:
1.加样品和标准品,37℃反应90分钟。不洗。
2.加生物素标记抗体,37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。
3.加ABC,37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。
4.TMB37℃反应20-25分钟。
5.加入TMB终止液,读数。

小鼠白介素6(IL-6)检测试剂盒原理:

问:同一样品多次活性测试结果差异大怎么解决?

 

答:样本保存不当,会导致多次实验结果偏差较大,样本应尽量减少反复冻融,如需多次检测,需在取样后分装保存。

问:检测样本是细胞培养上清,那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗?

 

答:有影响,所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。

问:请问标曲是每次都要做吗?

 

答:是的,每次实验,孵育时间,洗板次数等等条件均不一样,不同实验的标曲不能混用,做一次实验需要做一次标准曲线,并且用当次,同一块板上的标准曲线结果去计算板内样品的浓度,才能得到准确的结果。

问:做预实验时每种要做几个复孔呀?

 

答:预实验视情况而定,如果整个板子孔数较为充足,建议两个复孔,如不充足,单孔也可以。要尽量保证实验过程中加样准确。

问:血清样本少量溶血,颜色稍深,对结有影响吗?

 

答:会有影响,建议取样时需注意,避免溶血、脂血等样本。如样本条件受限,建议用样本稀释液适当稀释,减少基质效应影响。

问:试剂盒有推荐稀释浓度还需要自己测吗?

 

答:试剂盒一般会给出不同样品的推荐稀释比例,但是为大致范围,还是根据自己的样本情况,设计预实验测量计算。

问:加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大?

 

答:加完终止液后,显色反应也不是永远停止,形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深,建议在15 min内读数。

问:副孔差别比较大,是没洗干净吗?

 

答:复孔值差异较大,主要原因应考虑加样是否准确,洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。

问:配好的抗体没用完如何保存,可保存多久?预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂,剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗?

 

答:一般来讲,配好的母液,可以在四度保存,多一个月左右。剩下的板子和试剂是可以继续用于正式实验的,间隔时间不要太长,一个月之内均可,需注意试剂避免污染,板子保持干燥。

问:后显示的OD值在多少之间属于可用值,有要求吗?

 

答:有的,建议标准曲线高浓度点的OD值在2.0左右较好,也可参考说明书标曲的数据。

问:样本总是在标准曲线之外,稀释100倍也是,怎么办?

 

答:在设置稀释倍数之前,需要参考相关文献,对于一些表达极高的蛋白,确实会出现这种情况,建议继续提高稀释比例。

问:试剂盒推荐用450和540nm双波长检测,但条件有限可否换成450和620的双波长?如何使用校准波长?还有,用空白孔校准可以么?

 

答:可以的,TMB底物显色后,吸光峰值在450nm,另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置,避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值,用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法,因为避免了不同孔的读数影响,防止出现空白孔污染,导致读数较高,无法校准的情况。

问:ELISA可以检测胞内蛋白么?

 

答:可以的,选用支持组织匀浆的ELISA试剂盒即可,将组织样品或细胞样品进行裂解,提取胞内蛋白后进行蛋白定量,保证每孔上样总蛋白量一致即可。

问:ELISA试剂盒显色液是双组份的,有些其他品牌的是单组分的,使用单组分的有影响么?

 

答:HRP酶标二抗的ELISA试剂盒,显色底物一般为TMB,TMB不稳定,曝光或污染氧化后会出现显色反应,导致实验背景升高,或无法使用,所以爱必信的ELISA试剂盒将显色液调整为双组份,方便稳定保存,仅在使用前混合,避免了TMB的不稳定影响实验结果。如您选用的试剂盒为单组分显色液,在使用前检测是否为无色透明,如果是正常的,对结果也没有影响,可以放心使用。

问:整个过程需要避光吗?避光需要避到什么程度呢?

 

答:ELISA实验中,在酶标抗体孵育,以及显色底物孵育这两步建议避光,其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹,或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。

问:标准曲线在推荐的浓度下,r值为0.9,做了多次都是这样,怎么办?

 

答:要仔细核对产品说明书,看是否用了推荐的拟合方法,如爱必信的ELISA试剂盒,需要使用四参数拟合方式进行拟合,用错拟合方式,会导致r方值较低;如拟合方式无误,需检查是否有个别标曲孔数值异常,排查实验中是否出现污染或倍比稀释时出现失误。

问:封板膜什么时候用?每次加液后都要换吗?

 

答:封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体是,都要盖好封板膜,减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。

问:手动洗板过程中,拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗?

 

答:是需要更换的,防止造成交叉污染,影响实验结果的准确性。

问:有的wash buffer析出结晶后在37℃也不溶解,怎么办?

 

答:可提高至55度,并多次摇晃。溶解后按比例稀释即可使用。

问:测得的值都低于标准曲线的低值,是什么原因,应该怎么解决?

 

答:原因较多,首先是检查样品是否稀释倍数过高,降低稀释比,直至直接加样本原液,如还检测不出,需排查原因,建议在实验组别设置中添加阳性对照孔,用明确表达的样品作为阳性对照,如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度,则表明实验成功,其余待测样品表达含量低于检测下限,按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见,在健康样本中,表达含量极低。

问:因为检测限的原因,同一块ELISA板子,部分样本稀释,部分样本1:10稀释,部分1:20稀释,这样设置可行吗?结果可以比较吗?

 

答:可以比较,不同稀释比例,是因为不同样本间的表达差异较大,只要保证稀释后的检测样品测量值准确,还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。

问:试剂盒里面有捕获抗体么?

答:即用型ELISA试剂盒中,捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上,没有单独的捕获抗体提供,直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。

问:ELISA实验中,检测计算抗原的浓度,临界值怎么确定?

 

答:根据曲线测定的浓度,建议落在标准曲线的中间位置较好,极限不要超过标准曲线的上下限,如果超出较多,会影响计算结果准确性,建议调整稀释比例。

问:In vivo周期长的话,不太好做预实验,怎么办?

 

答:In vivo造模取样后,可将样品分装,取一部分样品做ELISA预实验,剩余样品再进行正式实验;如多批次实验,操作较为一致,后续可取消预实验,根据前期结果进行ELISA实验浓度设置。

问:做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢?多大是高多小是低?

 

答:需要根据文献推测,一般在健康人样本中,炎症因子表达很低,接近ELISA检测下限,样品无需稀释或1:1稀释即可,如已知为炎症疾病或造模样本,可参考文献,在预实验中设置1:10-100(或更高)的稀释比例,预实验检测后确定佳浓度进行正式实验。

问:ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机,需要如何操作?

 

答:实验室ELISA实验做的较多,还是建议使用洗板机洗板,效果更好,也更方便控制。如果没有洗板机,在洗板过程中,需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出,在加洗板液后,静置1-2min,甩干液体后,在吸水纸上大力拍干;重复三次。

问:ELISA实验中,酶标抗体识别的是哪个抗体?

 

答:在双抗夹心法ELISA中,酶标抗体识别的是检测抗体,对检测抗体进行识别和酶标记。

问:捕获抗体如何包被在96孔板上?

 

答:如果选用的是即用型ELISA试剂盒,无需进行抗体包被;如果是非即用型的ELISA试剂盒,首先,要选择ELISA级别的板子,材质应为聚苯乙烯;然后用抗体包被液稀释(pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl)成工作浓度,然后每孔加100 μl稀释后的捕获抗体,室温或4℃过夜包被,然后进行洗板和封闭之后即可使用,如需长期保存,需要真空冻干后保存

问:ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么?

 

答:不是的,在双抗夹心法ELISA实验中,会同时用到捕获抗体和检测抗体,这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体,这样才可以同时结合抗原分子。

问: ELISA可以测DNA的表观么?

 

答:不可以,ELISA是利用免疫学原理,定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学,主要是检测DNA甲基化,可以选用ChIP技术。

 

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