小鼠白介素6（IL-6）检测试剂盒

小鼠白介素6(IL-6)检测试剂盒

检测范围：15.6pg/ml→1000pg/ml。
特异性：系统和其它细胞因子无交叉反应。
敏感性：＜1pg/ml
保存：2-8℃（频繁使用时）；-20℃（长时间不用时）。
有效期：6个月(4℃)；12个月（-20℃）。
用途：用于体外定量分析小鼠血清、血浆、细胞培养上清、细胞裂解液

Interleukin-6，IL-6，白介素-6。IL-6是一种多功能细胞因子，在体内免疫反应调节、血细胞的增生、防御机制和急性期反应中起中心作用。既可由淋巴细胞产生，也能由非淋巴细胞合成，如单核/巨噬细胞，纤维母细胞，肝细胞，角化细胞，星形细胞，血管内皮细胞和各种肿瘤细胞。IL-6的合成受多种细胞因子、核分裂因子和抗原的刺激而增加。IL-6是一种糖蛋白，包含N-和O-连碳水化合物，分子量21KD-28KD。其糖蛋白成份并非功能所必须。本试剂盒所用的标准品为重组IL-6，有188个氨基酸。分子量21.8KDa。

所提供的IL-6 ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒（ELISA）。预先包被的抗体为单克隆抗体，克隆号MP520F3。检测相抗体为多克隆抗体，经生物素（biotin）标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应；经过PBS或TBS的*洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-6呈正相关。

试剂盒组成：

需要而未提供的试剂和器材：
1.标准规格酶标仪。
2.自动洗板机。
3.恒温箱
4.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器。
5.干净的试管和Eppendof管。
6.用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。

注意事项：
1．使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与厂家联系。
2．用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
3要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
4．为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
5．禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
6.本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。
7.揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。

洗板方法：
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将1X洗涤缓冲液至少300μL注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。

样品的准备和保存：
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
细胞培养上清——离心去除沉淀，立即分析或分装后-20℃冷冻保存
血浆——采用肝素、EDTA或柠檬酸盐抗凝，抽血后30分钟内离心1000×g 15分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血清——用干净试管收集血液，室温凝固30分钟，离心2000×g 20分钟，收集血清。标本立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
细胞裂解液——对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常10秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞，离心收集细胞，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入适量裂解液，用枪吹打把细胞吹散，用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000—14000g离心3-5分钟，取上清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。

样品稀释的一般原则：
用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案：
高——指待测因子在10-100ng/ml。一般按1：100稀释。297μL样品稀释液加3μL样品。
中——指待测因子在1-10ng/ml。一般按1：10稀释。225μL样品稀释液加25μL样品。
低——指待测因子在15.6-1000pg/ml。按1：2稀释。100μL样品稀释液加100μL样品。
特低——指待测因子≤15.6pg/ml。样品一般不做稀释，或按1：2稀释。
以上方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。

试剂的准备和保存：
A.IL-6标准品的稀释和使用。
试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。
1．配制10,000pg/ml标准品：取1ml样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后颠倒/搓动以助溶解。
2．配制1000pg/ml标准品：取100μL10,000pg/ml的标准品加入有0.9ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。
3．配制500pg/ml→15.6pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3ml样品稀释液，分别标记上500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml。取0.3ml 1000pg/ml的标准品加入标记500pg/ml的管中，混匀后同样取出0.3ml,加入下一只管中。余同此类推，直到后一只样品管。
注意：已经稀释的标准品（10,000pg/ml），应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下，2天内可以使用,但不得反复冻融。
B．生物素标记抗小鼠IL-6抗体工作液：在使用前2小时内准备。
1．根据每孔需要100μL计算总的用量（实际配制时应多配制100-200μL）。
2．按1μL生物素标记抗小鼠IL-6加抗体稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。
C．亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）工作液的准备：在使用前1小时内准备。
1．根据每孔需要100μL计算总的用量（实配时应多配制100-200μL）。
2．按1μL亲和素-过氧化物酶复合物（ABC）加ABC稀释液99μL的比例配制工作液。轻轻混匀。

操作步骤：
已稀释好的ABC 和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
1．确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。
2．将1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的标准品各100μL依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于小鼠血清、血浆、细胞培养上清、细胞裂解液，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μL。
3．酶标板加上封板膜，37℃反应90分钟。
4．反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。
5．将准备好的生物素抗小鼠IL-6抗体工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟。
6．1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
7．将准备好的ABC工作液按每孔100μL依次加入（TMB空白显色孔除外）。酶标板加上封板膜，37℃反应30分钟。
8．1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右（每孔洗液至少300μL）。
9．按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应20-25分钟（注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。
10．按每孔100μL依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。
11．用酶标仪在450nm测定O.D.值。
有两种设定空白对照的方案：
（1）将TMB空白显色孔(只加TMB显色液和终止液)设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
（2）将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
12．根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。

操作步骤总结：
1．加样品和标准品，37℃反应90分钟。不洗。
2．加生物素标记抗体，37℃反应60分钟。1X洗涤缓冲液洗涤3次。
3．加ABC，37℃反应30分钟。1X洗涤缓冲液洗涤5次。
4．TMB37℃反应20-25分钟。
5．加入TMB终止液，读数。

小鼠白介素6(IL-6)检测试剂盒原理:

问：同一样品多次活性测试结果差异大怎么解决？

答：样本保存不当，会导致多次实验结果偏差较大，样本应尽量减少反复冻融，如需多次检测，需在取样后分装保存。

问：检测样本是细胞培养上清，那么细胞数目对炎症因子的浓度有影响吗？

答：有影响，所以不同样本可以比较的前提条件是培养细胞数水平接近一致。

问：请问标曲是每次都要做吗？

答：是的，每次实验，孵育时间，洗板次数等等条件均不一样，不同实验的标曲不能混用，做一次实验需要做一次标准曲线，并且用当次，同一块板上的标准曲线结果去计算板内样品的浓度，才能得到准确的结果。

问：做预实验时每种要做几个复孔呀？

答：预实验视情况而定，如果整个板子孔数较为充足，建议两个复孔，如不充足，单孔也可以。要尽量保证实验过程中加样准确。

问：血清样本少量溶血，颜色稍深，对结有影响吗？

答：会有影响，建议取样时需注意，避免溶血、脂血等样本。如样本条件受限，建议用样本稀释液适当稀释，减少基质效应影响。

问：试剂盒有推荐稀释浓度还需要自己测吗？

答：试剂盒一般会给出不同样品的推荐稀释比例，但是为大致范围，还是根据自己的样本情况，设计预实验测量计算。

问：加完终止液之后测的几次数据差别也蛮大？

答：加完终止液后，显色反应也不是永远停止，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在15 min内读数。

问：副孔差别比较大，是没洗干净吗？

答：复孔值差异较大，主要原因应考虑加样是否准确，洗板过程中是否有残留以及是否有交叉污染。

问：配好的抗体没用完如何保存，可保存多久？预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂，剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗？

答：一般来讲，配好的母液，可以在四度保存，多一个月左右。剩下的板子和试剂是可以继续用于正式实验的，间隔时间不要太长，一个月之内均可，需注意试剂避免污染，板子保持干燥。

问：后显示的OD值在多少之间属于可用值，有要求吗？

答：有的，建议标准曲线高浓度点的OD值在2.0左右较好，也可参考说明书标曲的数据。

问：样本总是在标准曲线之外，稀释100倍也是，怎么办？

答：在设置稀释倍数之前，需要参考相关文献，对于一些表达*的蛋白，确实会出现这种情况，建议继续提高稀释比例。

问：试剂盒推荐用450和540nm双波长检测，但条件有限可否换成450和620的双波长？如何使用校准波长？还有，用空白孔校准可以么？

答：可以的，TMB底物显色后，吸光峰值在450nm，另外的校准波长是防止气泡等杂质造成的干扰设置，避开450左右50nm以上即可。两次读取的OD值，用OD450 - OD校准波长即可。尽量还是建议有条件的选用双波长校准的方法，因为避免了不同孔的读数影响，防止出现空白孔污染，导致读数较高，无法校准的情况。

问：ELISA可以检测胞内蛋白么？

答：可以的，选用支持组织匀浆的ELISA试剂盒即可，将组织样品或细胞样品进行裂解，提取胞内蛋白后进行蛋白定量，保证每孔上样总蛋白量一致即可。

问：ELISA试剂盒显色液是双组份的，有些其他品牌的是单组分的，使用单组分的有影响么？

答：HRP酶标二抗的ELISA试剂盒，显色底物一般为TMB，TMB不稳定，曝光或污染氧化后会出现显色反应，导致实验背景升高，或无法使用，所以爱必信的ELISA试剂盒将显色液调整为双组份，方便稳定保存，仅在使用前混合，避免了TMB的不稳定影响实验结果。如您选用的试剂盒为单组分显色液，在使用前检测是否为无色透明，如果是正常的，对结果也没有影响，可以放心使用。

问：整个过程需要避光吗？避光需要避到什么程度呢？

答：ELISA实验中，在酶标抗体孵育，以及显色底物孵育这两步建议避光，其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹，或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。

问：标准曲线在推荐的浓度下，r值为0.9，做了多次都是这样，怎么办？

答：要仔细核对产品说明书，看是否用了推荐的拟合方法，如爱必信的ELISA试剂盒，需要使用四参数拟合方式进行拟合，用错拟合方式，会导致r方值较低；如拟合方式无误，需检查是否有个别标曲孔数值异常，排查实验中是否出现污染或倍比稀释时出现失误。

问：封板膜什么时候用？每次加液后都要换吗？

答：封板膜在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体是，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。每次使用后要更换新的封板膜。

问：手动洗板过程中，拍过抗体或抗原的滤纸需要扔吗？

答：是需要更换的，防止造成交叉污染，影响实验结果的准确性。

问：有的wash buffer析出结晶后在37℃也不溶解，怎么办？

答：可提高至55度，并多次摇晃。溶解后按比例稀释即可使用。

问：测得的值都低于标准曲线的低值，是什么原因，应该怎么解决？

答：原因较多，首先是检查样品是否稀释倍数过高，降低稀释比，直至直接加样本原液，如还检测不出，需排查原因，建议在实验组别设置中添加阳性对照孔，用明确表达的样品作为阳性对照，如果标准曲线及阳性样品均可测得正常的表达浓度，则表明实验成功，其余待测样品表达含量低于检测下限，按照0计算即可。这种情况尤其对于炎症因子较为常见，在健康样本中，表达含量极低。

问：因为检测限的原因，同一块ELISA板子，部分样本稀释，部分样本1:10稀释，部分1:20稀释，这样设置可行吗？结果可以比较吗？

答：可以比较，不同稀释比例，是因为不同样本间的表达差异较大，只要保证稀释后的检测样品测量值准确，还原回稀释倍数后的浓度是可信的。可以用来比较不同样本的原始浓度差。

问：试剂盒里面有捕获抗体么？

答：即用型ELISA试剂盒中，捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上，没有单独的捕获抗体提供，直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。

问：ELISA实验中，检测计算抗原的浓度，临界值怎么确定？

答：根据曲线测定的浓度，建议落在标准曲线的中间位置较好，极限不要超过标准曲线的上下限，如果超出较多，会影响计算结果准确性，建议调整稀释比例。

问：In vivo周期长的话，不太好做预实验，怎么办？

答：In vivo造模取样后，可将样品分装，取一部分样品做ELISA预实验，剩余样品再进行正式实验；如多批次实验，操作较为一致，后续可取消预实验，根据前期结果进行ELISA实验浓度设置。

问：做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢？多大是高多小是低？

答：需要根据文献推测，一般在健康人样本中，炎症因子表达很低，接近ELISA检测下限，样品无需稀释或1:1稀释即可，如已知为炎症疾病或造模样本，可参考文献，在预实验中设置1:10-100（或更高）的稀释比例，预实验检测后确定佳浓度进行正式实验。

问：ELISA实验中的洗板步骤如果没有洗板机，需要如何操作？

答：实验室ELISA实验做的较多，还是建议使用洗板机洗板，效果更好，也更方便控制。如果没有洗板机，在洗板过程中，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置1-2min，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。

问：ELISA实验中，酶标抗体识别的是哪个抗体？

答：在双抗夹心法ELISA中，酶标抗体识别的是检测抗体，对检测抗体进行识别和酶标记。

问：捕获抗体如何包被在96孔板上？

答：如果选用的是即用型ELISA试剂盒，无需进行抗体包被；如果是非即用型的ELISA试剂盒，首先，要选择ELIS*别的板子，材质应为聚苯乙烯；然后用抗体包被液稀释（pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl）成工作浓度，然后每孔加100 μl稀释后的捕获抗体，室温或4℃过夜包被，然后进行洗板和封闭之后即可使用，如需长期保存，需要真空冻干后保存

问：ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么？

答：不是的，在双抗夹心法ELISA实验中，会同时用到捕获抗体和检测抗体，这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体，这样才可以同时结合抗原分子。

问： ELISA可以测DNA的表观么？

答：不可以，ELISA是利用免疫学原理，定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学，主要是检测DNA甲基化，可以选用ChIP技术。