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牛呼肠孤病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

牛呼肠孤病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒会引起鲍病毒病,危害的主要对象是我国 南方养殖的九孔鲍、杂色鲍,北方地区养殖的皱纹盘鲍。该病潜伏期短,发病急,传染 性强,死亡率高,造成鲍种苗及成鲍的大量死亡,4~30d 内死亡率高达 95%以上,溶 藻胶弧菌和副溶血弧菌可能会和病毒共同感染鲍并且是鲍病的共同致病因子。

  • 产品型号:50次
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2020-07-27
  • 访  问  量:352
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详细介绍
品牌其他品牌货号XY-0152
规格50T供货周期一周
主要用途荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。应用领域医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业

牛呼肠孤病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

Bovine Coronavirus(BCoV)

产品及特点

呼肠孤病毒是具分节段的双链 RNA 基因组的一类病毒,分布广,病毒粒呈球 形,大小在 60-80 纳米之间的 20 面体结构。本产品是基于染料法荧光定量 PCR 原理开发,专门检测牛呼肠孤病毒的试剂盒。它具有下列特点:

1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。

2. 根据牛呼肠孤病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 检测,灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍,可以达 到至少 1000 拷贝/反应。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技术,RT 和 PCR 两步在一个试管内完成,不需要中 间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。

牛呼肠孤病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分

编号

成  份

规格

试剂一

2×qRT-PCR 缓冲液

500 μL(棕色管)

试剂二

10×qRT-PCR 酶混合液 

100 μL(红盖)

试剂三

ROX 染料 I,50×

20 μL(棕色管)

试剂四

ROX 染料 II,50×

20 μL(棕色管) 

试剂五

荧光 PCR 模板稀释液

1mL(黄盖)

试剂六

牛呼肠孤病毒染料法 qRT-PCR 引物 混合液 

100 μL(白盖)

试剂七

牛呼肠孤病毒染料法 qRT-PCR 阳性 对照(1×10E8 拷贝/μL)

50 μL(黄盖)

试剂

使用手册

1份

运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需 要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供 RNA 段作为阳性对照。 

自备试剂 样品RNA

使用方法 一、稀释阳性对照(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非 常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩 散传染性病原。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液,用带芯枪头,下同)。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分 震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重 复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

5. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的阳性对 照梯度稀释液中的第 4 号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷 贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样 品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提 取试剂盒兼容。

三、设置 RT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用 于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线。如 果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用 于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用 于 PCR 阳性对照(用第 4 号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析 的步骤,定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个,其余不变。

8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置 完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后后加):

成分

样品

标准品 (8-10 管) 

阴性对照

2×qRT-PCR 缓冲液

10μL

10μL

各 10μL

牛呼肠孤病毒染料法 qRTPCR 引物混合液 

2μL

 2μL

 2μL

50×ROX (见注)

0.4μL 

0.4μL

 各 0.4μL

 样品制备所得 RNA 模板 (来于第 8 步)

5.6μL

 

 

稀释所得 6 个阳性对照(来 于第 6 步)

 

 

各 5.6μL(2 号 样到 2 号管,3 号样到 3 号 管…)

 10×qRT-PCR 酶混合液 2μL 2μL 2μL

9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。

过程

温度

时间

RT(逆转录)

95℃ 

30 min

 预变性 95℃  10 min

qPCR 反应 (40 个循环)

95℃

15 sec

60

1 min(采集 SYBR 通道的荧光信 号)

 按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

10. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于 或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于 或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等 于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。

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