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犬瘟热病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

犬瘟热病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒会引起鲍病毒病,危害的主要对象是我国 南方养殖的九孔鲍、杂色鲍,北方地区养殖的皱纹盘鲍。该病潜伏期短,发病急,传染 性强,死亡率高,造成鲍种苗及成鲍的大量死亡,4~30d 内死亡率高达 95%以上,溶 藻胶弧菌和副溶血弧菌可能会和病毒共同感染鲍并且是鲍病的共同致病因子。

  • 产品型号:50次
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2020-07-28
  • 访  问  量:373
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详细介绍
品牌其他品牌货号XY-0176
规格50T供货周期一周
主要用途荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。应用领域医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业

犬瘟热病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

Canine Distemper Virus(CDV)

产品及特点

犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus,CDV)属于病原性病毒。主要侵 犯狗科、鼬科动物。属于副粘液病毒。感染的狗(尤其是幼狗)在 4—5 天的潜 伏期后出现发热,流泪,流鼻涕,呕吐,腹泻,便粘液,有时有抽风、痉挛等症 状,死亡率约 50%。因此快速灵敏诊断具有重要意义。本产品就是以探针法荧光 定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测犬瘟热病毒的试剂盒,它具有下列特 点: 

1. 即开即用,用户只需要提供样品 RNA 模板。

2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。

3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4. 特异性高,引物是根据犬瘟热病毒高度保守区设计,不会跟其他病毒的 RNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研

犬瘟热病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分

编号

成分

规格

试剂一

2×Probe qPCR MagicMix

500 μL(本色盖) 

试剂二

荧光 PCR 模板稀释液

1 mL(黄盖) 

试剂三

犬瘟热病毒 qPCR 引 物混合液

100 μL(白盖)

试剂四

犬瘟热病毒 qRT-PCR 探针 (5 μM)

100 μL(棕色管)

试剂五犬瘟热病毒 qRT-PCR 阳性对照 2.0(1×10E8 拷贝/μL) 50 μL(红盖)
试剂 天净沙核酸释释剂试用装20 次(1mL,绿盖) 
试剂使用手册1 份

运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。  

自备试剂  样品 DNA。 

使用方法 一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 模板稀释液,用带芯枪 头,下同)。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7. 如果有 N 个样品,设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。

三、Probe qRT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后后加): 

成分

样品管 N+2 个

RT-PCR 阴性对照 管

标准曲线 样品管 (2-7 管)

2×Probe qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

10 μL

犬瘟热病毒 qRT-PCR 探针

1 μL

1 μL

各 2 μL

 犬瘟热病毒 RT-PCR 引物混合2 μL2 μL 各 2 μL

待测样品 RNA 模板

各 6 μL

 

 

超纯水  6 μL 
 第 7 步所得标准曲线样品稀释液 (2-7 号)   各 6 μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…)

11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:

过程

温度

时间

 逆转录 42℃ 30 min
 预变性95℃5 min

 

RT-PCR 反应 (40 个循环)

93℃ 

0.5 min

55℃0.5 min(采集 FAM 通道的荧 光信号)

72℃ 

 0.5 min

 后延伸 72℃ 10 min

 

五、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。

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