牛棒杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。
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品牌 | 其他品牌 | 货号 | XY-0221 |
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规格 | 50T | 供货周期 | 一周 |
主要用途 | 荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。 | 应用领域 | 医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业 |
牛棒杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒
Corynebacterium bovis
产品及特点
牛棒状杆菌病(Bovine Corynebacteriosis)是指由棒状杆菌属(Coryne bacterium spp.)的某些细菌引起的膀胱炎和肾盂肾炎。临床主要特征为频尿、 浊尿、血尿和发热。该病主要见于成年母牛,多在妊娠期和产后发病。本病分布 于世界各地。本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测牛 棒杆菌的试剂盒,它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供 DNA 模板。
2. 特异性高,引物是根据牛棒杆菌高度保守区设计,不会扩增其他微生物。
3. 引物和扩增体系经过优化,灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。
4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照,便于区分假阴性样品。
5. 一管式操作,荧光 PCR 检测,不容易产生环境污染。
6. 本产品只能用于科研,本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。
牛棒杆菌染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 2×PCR MagicMix | 500μL(棕色) |
试剂二 | 荧光 PCR 模板稀释液 | 1 mL(黄盖) |
试剂三 | 牛棒杆菌染料法 qPCR 引物混 合液 | 100 μL(白盖) |
试剂四 | 牛棒杆菌染料法 qPCR 阳性对 照(1×10E8 拷贝/μL) | 50μL(红盖) |
试剂五 | 天净沙核酸释放剂试用装 | 20 次(1mL,绿盖)) |
试剂六 | 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法 一、制备标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液,用带芯枪头, 下同)。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照(其浓度为 1×10E8 拷贝/μL,试剂盒提 供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 用自选方法纯化样品的 DNA,本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8. 如果有 N 个样品,则需要进行 N+2 个样品提取,多出的一个用作样品制备 阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。
三、设置 qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9. 如果进行定量分析,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线样品。如果做定 性分析,则 6 个标准曲线样品只选一个做(可以选 4 号,其余样品不变)。 以下只介绍定量分析的反应设置。
10. 在标记管中按下表加入各成分:
成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性 对照管 | 标准曲线 样品管(2-7 管) |
2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
牛棒杆菌染料法 qPCR 引物 混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自备 10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
N+2 个待测样品 DNA 模板 | 6 μL |
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自备超纯水 | 6 μL | ||
第 7 步所得 PCR 阳性对照 稀释液(2-7 号) |
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| 各 6μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…) |
11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR(具体 PCR 参数可以根据仪器不同 而自行优化)。
四、荧光定量 PCR 反应参数
过程 | 温度 | 时间 |
预热 | 50℃ | 2 min |
预变性 | 95℃ | 10 min |
PCR 反应 (40 个循环) | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min(采集 SYBR 通道的荧 光信号) |
五、数据处理
12. 设定 60℃-96℃范围的熔解曲线分析,排除假阳性。
13. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
14. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 32。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 32 则为阴性,如果小 于或等于 30 则为阳性。如果在 30-32 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 32 则为阴性,如果小于 30,则为阳性。
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