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隐孢子虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒

隐孢子虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。

  • 产品型号:50次
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2020-07-29
  • 访  问  量:349
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详细介绍
品牌其他品牌货号XY-0236
规格50T供货周期一周
主要用途荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。应用领域医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业

隐孢子虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒

Cryptosporidium spp

产品及特点

隐孢子虫(Cryptosporidium)为体积微小的球虫类寄生虫,广泛存在多种脊椎动 物体内,寄生于人和大多数哺乳动物的主要为微小隐孢子虫(C. parvum),引起隐孢子 虫病(cryptosporidiosis),是一种以腹泻为主要临床表现的人畜共患性原虫病,因此对 隐孢子虫进行快速灵敏的诊断具有重要的意义。本产品就是根据隐孢子虫 rRNA 编码基 因的保守区设计引物而开发的高灵敏荧光定量 PCR 产品。本试剂盒具有下列特点: 

1. 根据隐孢子虫 OWP(oocyst wall protein)编码基因保守序列设计的专一性引物, 与其他肠道疾病病原体 

2. 灵敏度比常规 PCR 高 2-3 个数量级,可以达到几十拷贝/反应。

3. 即开即用,用户只需要提供样品模板,操作简单,定量准确快速。

4. 一管式荧光定量 PCR 检测,避免后续污染。

5. 本试剂盒足够 100 次 20uL 反应体系的荧光定量 PCR。

6. 本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。

隐孢子虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

 

编号

成分

规格

试剂一

2×PCR MagicMix

0.5 mL(装 A 袋) 

试剂二

超纯水 

1 mL(装 A 袋)

试剂三

隐孢子虫 PCR 引物 F 

0.5 OD(装 B 袋)

试剂四

隐孢子虫 PCR 引物 R

0.5 OD(装 B 袋)

试剂五 隐孢子虫基因阳性对照 (1×10E8 copy/μL) 50 μL(装 C 袋) 

试剂六

使用手册

1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存(A 袋试剂放样品准备区、C 袋的阳性对照分开放置),有效期 一年。 

自备试剂  DNA 模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。

使用方法 一、样品 DNA 的制备

1. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数原虫 DNA 提取试剂盒兼 容。本公司的柱式粪便 DNA 提取试剂盒也可以用于隐孢子虫 DNA 提取。 二、引物的制备(在样品制备室进行)

2. 按引物标签提示在装引物干粉的管中直接加入适量的超纯水(加入量见引物试管上 的标签),使得两条引物的浓度均为 10μM(10pmol/μL),然后各取 110μL 混 合在一起得 220μL,标注为引物混合物,放冰上待用。220μL 足够 100 次 qPCR 反应。

三、稀释阳性对照

(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高, 因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成 分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照, 只提供可以直接使用的长为 150bp 的 DNA 段作为阳性对照。

3. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

4. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水(用带芯枪头,下同)。

5. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得), 充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 换枪头,从 6 号管中取 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分震 荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

8. 换枪头,从 5 号管中取 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中,得 1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

9. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

三、设置 qPCR 反应(20 μL 体系,在样品制备室进行) 10. 在 PCR 管中加入下列成分(待测样品需要做三次重复,下表只列出一次。样品管 和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子 储存好后后加): 

成分

样品管 N+2 个

PCR 阴性 对照管

标准曲线 样品管(2-7 管)

2×qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

各 10 μL

引物混合物

2 μL

2 μL

各 2 μL

自备 10×ROX (见注)

2 μL

2 μL

 2 μL

待测样品 DNA 模板 

1-5 μL

 

 

阳性对照(2-7 号)    各 5μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…) 

补水到 

20 μL  

20 μL  

20 μL 

11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR(具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行 优化)。

过程

温度

时间

预变性

95℃

3 分钟

 

PCR 反应 (45 个循环)

95℃

30 秒 

55℃ 30 秒 

72℃

30 秒 

12. 数据采集 具体操作按所用仪器推荐的流程进行。一般在复性步骤采集荧光数据。本产品中所 含的荧光染料在不结合 DNA 时,大吸收光谱在 471 nm,结合 DNA 时的大 吸收光谱在 500 nm,大发射光谱在 530 nm。

四、数据处理

13. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品 的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。 

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