哈扎拉病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

哈扎拉病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

Hazara Virus

产品及特点

哈扎拉病毒(Hazara Virus)是一种RNA病毒，属于克里米亚刚果出血热血清型，目前尚未发现其自然宿主，已有报道证实感染该病毒能引起新生小鼠的死亡，但是并未发现对人类具有致命性的哈扎拉病毒。由于克里米亚-刚果出血热传播地域广泛，致死率高，给人体健康带来较大的风险，因此哈扎拉病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点：

1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2.根据哈扎拉病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

哈扎拉病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供RNA段作为阳性对照。

自备试剂  样品RNA

使用方法 一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非 常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂 盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样 品做阳性对照，只提供无传染性的的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧 光 PCR 模板稀释液，用带芯枪头，下同）。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。 二、样品 RNA 的制备

6. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照 梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝） 再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品 体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。

7. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提 取试剂盒兼容。 

三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

8. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照，6 个用于 RT-PCR 阳性对照。 9. 在标记管中按下表加入各成分： 

10. 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

四、数据处理
10.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
11.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。