丁型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

丁型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

Hepatitis D Virus(HDV)

产品及特点

丁型肝炎病毒（Hepatitis Delta Virus，HDV）是一种缺陷病毒，必须在 HBV 或其他嗜肝 DNA 病毒的辅助下才能复制增殖。HDV 与 HBV 重叠感染后， 可促使肝损害加重，并易发展为慢性活动性肝炎、肝硬化和重型肝炎。HDV 的 感染呈世界性分布，但主要分布于南意大利和中东等地区，主要通过输血、密切 接触和母婴传播。HDV 给人类健康造成重大威胁，因此灵敏快捷的诊断产品具 有重要的意义。本产品基于 PCR 原理开发。它具有下列特点：

1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2. 根据 HDV 的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。 
3.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

丁型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒​​规格及成分

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供RNA段作为阳性对照。

自备试剂  样品RNA

使用方法 一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非 常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂 盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样 品做阳性对照，只提供无传染性的的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧 光 PCR 模板稀释液，用带芯枪头，下同）。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。 二、样品 RNA 的制备

6. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照 梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝） 再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品 体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。

7. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提 取试剂盒兼容。 

三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

8. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照，6 个用于 RT-PCR 阳性对照。

9. 在标记管中按下表加入各成分： 

10. 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

四、数据处理

10. 如果PCR阳性对照和PCR阴性对照均得到预期阳性和阴性结果，则说明PCR 有效，可以进行后续分析。以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴， 绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

11. 如果 PCR 阳性对照或 PCR 阴性对照任何一个没有得到预期阳性和阴性结果， 则说明 PCR 实验无效或污染，不需要进行后续分析，请跟厂家联系。

12. 如果样品制备阳性对照或样品制备阴性对照均得到预期阳性和阴性结果，说 明样品制备操作有效，实验结果有效。

13. 如果样品制备阳性对照或样品制备阴性对照任何一个没有得到预期结果（如 样品制备阳性对照无扩增，或样品制备阴性对照有扩增），说明样品制备操作 无效或有污染，实验结果无效，需要重复样品制备过程或请跟厂家联系。