戊型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

戊型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

Hepatitis E Virus(HEV)

产品及特点

戊型肝炎(Hepatitis E )是一种经粪一口传播的急性传染病。HEV 是单股正链 RNA 病毒，呈球形、直径 27~34nm 无囊膜，核衣壳呈二十面体立体对称。戊型 肝炎病毒(HEV)为无包膜的球状颗粒，分为 1~8 共 8 个基因型，中国内地流行株 主要为 1 型(曾称缅甸株)，其次为 4 型。目前尚不能对 HEV 进行细胞培养，可实 验室感染猕猴等多种猴类，HEV 对外界环境抵抗力不强。戊型肝炎传播途径(主要 经粪-口途径传播)和临床表现(隐性感染及急性肝炎，不致慢性肝炎等)与甲型肝炎 相似。戊型肝炎在 15~39 岁的青年和成人高发。戊型肝炎亦为自限性疾病。HEV 对肝细胞亦无直接病变作用(CPE)。机体于病后可获得一定的免疫力，但不够稳固。 目前无戊型肝炎疫苗，预防戊型肝炎采用切断粪-口传播途径为主的措施。本产品 是基于染料法荧光定量 PCR 原理开发，专门检测戊型肝炎病毒的试剂盒。它具有 下列特点：

1.一站式，用于不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2.根据戊型肝炎病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3.基于染料法qRT-PCR检测，灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍，可以达到至少1000拷贝/反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术，RT和PCR两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品足够50次30μL体系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于临床。

戊型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供RNA段作为阳性对照。

自备试剂  样品RNA

使用方法 一、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非 常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂 盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样 品做阳性对照，只提供无传染性的的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧 光 PCR 模板稀释液，用带芯枪头，下同）。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供)，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。 二、样品 RNA 的制备

6. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的阳性对照 梯度稀释液中的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝） 再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品 体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。

7. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提 取试剂盒兼容。 

三、设置 RT-PCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

8. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照，6 个用于 RT-PCR 阳性对照。 9. 在标记管中按下表加入各成分： 

9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR（参数可能会因仪器不同而需优化）。

四、数据处理 10. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于 或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等 于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。