戊型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。
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品牌 | 其他品牌 | 货号 | XY-0360 |
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规格 | 50T | 供货周期 | 一周 |
主要用途 | 荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。 | 应用领域 | 医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业 |
戊型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
Hepatitis E Virus(HEV)
产品及特点
戊型肝炎(Hepatitis E )是一种经粪一口传播的急性传染病。HEV 是单股正链 RNA 病毒,呈球形、直径 27~34nm 无囊膜,核衣壳呈二十面体立体对称。戊型 肝炎病毒(HEV)为无包膜的球状颗粒,分为 1~8 共 8 个基因型,中国内地流行株 主要为 1 型(曾称缅甸株),其次为 4 型。目前尚不能对 HEV 进行细胞培养,可实 验室感染猕猴等多种猴类,HEV 对外界环境抵抗力不强。戊型肝炎传播途径(主要 经粪-口途径传播)和临床表现(隐性感染及急性肝炎,不致慢性肝炎等)与甲型肝炎 相似。戊型肝炎在 15~39 岁的青年和成人高发。戊型肝炎亦为自限性疾病。HEV 对肝细胞亦无直接病变作用(CPE)。机体于病后可获得一定的免疫力,但不够稳固。 目前无戊型肝炎疫苗,预防戊型肝炎采用切断粪-口传播途径为主的措施。本产品 是基于染料法荧光定量 PCR 原理开发,专门检测戊型肝炎病毒的试剂盒。它具有 下列特点:
1.一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。
2.根据戊型肝炎病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。
3.基于染料法qRT-PCR检测,灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍,可以达到至少1000拷贝/反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术,RT和PCR两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品足够50次30μL体系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。
戊型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分
编号 |
成 份
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规格 |
试剂一 | 2×qRT-PCR 缓冲液 | 500 μL(棕色管) |
试剂二 | 10×qRT-PCR酶混合液 | 100 μL(红盖) |
试剂三 | ROX染料I | 50 μL(棕色管) |
试剂四 | ROX染料II | 50 μL(棕色管) |
试剂五 | 荧光PCR模板稀释液 | 1mL(亮黄盖) |
试剂六 | 戊型肝炎病毒RT-PCR引物混合液 | 100 μL(白盖) |
试剂七 | 戊型肝炎病毒RT-PCR阳性对照 (1×10E8拷贝/μL) | 50 μL(黄盖) |
试剂八 | 使用手册 | 1份 |
运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。阳性对照需要因易污染其他成分需要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供RNA段作为阳性对照。
自备试剂 样品RNA
使用方法 一、稀释阳性对照(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非 常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂 盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样 品做阳性对照,只提供无传染性的的 DNA 段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧 光 PCR 模板稀释液,用带芯枪头,下同)。
2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分 震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
3. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。 二、样品 RNA 的制备
6. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的阳性对照 梯度稀释液中的第 4 号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝) 再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品 体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
7. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提 取试剂盒兼容。
三、设置 RT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
8. 如果只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 RT-PCR 阴性对照,6 个用于 RT-PCR 阳性对照。 9. 在标记管中按下表加入各成分:
成分 | N+2个制备所得样品 | RT-PCR阴性对照 | RT-PCR阳性 对照(2-7管) |
2×qRT-PCR 缓冲液 | 10μL | 10μL | 各10μL |
戊型肝炎病毒染料法 qRTPCR 引物混合液 | 2μL | 2μL | 各2μL |
50×ROX (见注) | 0.4μL | 0.4μL | 各0.4μL |
样品制备所得RNA模板(来于第8步) | 5.6μL | 不加 | 不加 |
稀释所得6个阳性对照(来于第6步) | 不加 | 不加 | 各5.6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…) |
10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
9. 上机后按下面参数进行 RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
过程 | 温度 | 时间 |
RT(逆转录) | 50℃ | 30 min |
预变性 | 94℃ | 10 min |
qPCR 反应 (40 个循环) | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min(采集 SYBR 通道的荧光信号) | |
按仪器预设程序进行溶解曲线分析 |
四、数据处理 10. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于 或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于 或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等 于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。
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