李斯特菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。
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品牌 | 其他品牌 | 货号 | XY-0462 |
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规格 | 50T | 供货周期 | 一周 |
主要用途 | 荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。 | 应用领域 | 医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业 |
李斯特菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒
Listeria spp.
产品及特点
李斯特菌(Listeria spp.)是一种兼性厌氧细菌,为李斯特菌症的病原体。李斯特菌是革兰氏阳性菌,属厚壁菌门,取名自约瑟夫·李斯特。它主要以食物为传染媒介,是致命的食源性病原体之一,感染后健康成人可出现轻微类似流感症状,易感者突然发热,剧烈头痛、恶心、呕吐、腹泻、败血症、脑膜炎、孕妇出现流产,给人体健康带来较大的损害,因此李斯特菌的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术,本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测李斯特菌通用的试剂盒,它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4.特异性高,引物是根据人李斯特菌通用高度保守的VP1区设计,不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
李斯特菌通用探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 2×Probe qRT-PCR MagicMix | 500 μL(本色盖) |
试剂二 | 荧光 PCR 模板稀释液 | 1 mL(黄盖) |
试剂三 | 人李斯特菌通用PCR引物 | 100 μL(白盖) |
试剂四 | 人李斯特菌通用qPCR探针 | 50 μL(棕色管) |
试剂五 | 人李斯特菌通用阳性对照2.0 (1×10E8拷贝/μL) | 50 μL (红盖) |
试剂六 | 天净沙核酸释释剂(试用装) | 50次(试用装) |
试剂七 | 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法 一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 模板稀释液,用带芯枪 头,下同)。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
7. 如果有 N 个样品,设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
三、Probe qRT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后后加):
成分 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照管 | 标准曲线 样品管(2-7管) |
2×Probe qPCR MagicMix(本色盖) | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
人李斯特菌通用qPCR探针(绿盖) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
人李斯特菌通用 PCR引物混合液(白盖) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
待测样品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号) | 不加 | 不加 | 各6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…) |
11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 94℃ | 5 min |
PCR反应 (40个循环) | 94℃ | 0.5 min |
50℃ | 0.5 min(采集FAM通道的荧光信号) | |
72℃ | 0.5 min | |
后延伸 | 72℃ | 10min |
五、数据处理
12.以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。
六、电泳检测
13.如果有必要电泳确认,可取10-20μL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400 bp。但电泳非常容易污染实验环境,建议不轻易采纳。
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