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小鼠白血病病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

型    号:50次
所属分类:PCR-染料法
报    价: 市场价:3790
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小鼠白血病病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。

小鼠白血病病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒产品概述:

小鼠白血病病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

Mouse Leukemia Virus(MLV)

产品及特点

小鼠白血病病毒(murine leukemia virus,MLV)具有致小鼠白血病活性的 RNA 肿瘤病毒。是常用的载体。由于逆转录病毒载体只转导分裂细胞,而大部 分 RA 滑膜内细胞分裂并不活跃,所以主要采用体外基因治疗。本产品以探针法 荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测小鼠白血病病毒的试剂盒,它具有 下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。

3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4. 特异性高,引物是根据小鼠白血病病毒高度保守区设计,不会跟其他病毒的 RNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。

小鼠白血病病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分

编号

成分

规格

试剂一

探针法 qRT-PCR 缓冲液

500μL(蓝盖) 

试剂二

探针法 qRT-PCR 酶混合液

 100μL(红盖)

试剂三

荧光 PCR 模板稀释液

1 mL(亮黄盖)

试剂四

小鼠白血病病毒探针法 q

100 μL(白盖)

试剂五小鼠白血病病毒 qRT-PCR 探针 50 μL(棕色管)
试剂 小鼠白血病病毒探针法 qRT-PCR 阳性对照(1×10E8 拷贝/μL)50 μL(黄盖) 

试剂

使用手册

1 份

运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。 

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 模板稀释液,用带芯枪 头,下同)。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7. 如果有 N 个样品,设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。

三、Probe qRT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后后加): 

成分

样品管 N+2 个

PCR 阴性 对照管

标准曲线 样品管(2-7 管)

探针法 qRT-PCR 缓冲液

10 μL

10 μL

10 μL

探针法 qRT-PCR 酶混合液

 各 2 μL

 2 μL

 各 2 μL

 小鼠白血病病毒 qRT-PCR 探针各 1 μL1 μL 各1 μL

小鼠白血病病毒探针法 qRT-PCR 引物混合液

各 2 μL

 2 μL

 各 2 μL

待测样品 RNA 模板 各 5 μL  
超纯水  5 μL 
 第 7 步所得标准曲线样品稀释液 (2-7 号)   各 5 μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…)

11. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR:

过程

温度

时间

 逆转录50℃30 min
 预变性 94℃ 10 min

 

qRT-PCR 反应 (40 个循环)

94℃

15sec

60℃

1 min(采集 FAM 通道的荧光 信号)

 

五、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值 为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 35,则为阳性。

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