血吸虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒，根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛，可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在，主要侵犯外胚层发育而成的组织，例如：皮肤、粘膜和神经组织。
产品型号：50次厂商性质：生产厂家更新时间：2020-08-12访 问 量：352
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| 品牌 | 其他品牌 | 货号 | XY-0656 |
|---|---|---|---|
| 规格 | 50T | 供货周期 | 一周 |
| 主要用途 | 荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。 | 应用领域 | 医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业 |
血吸虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒
Schistosoma spp.
产品及特点
血吸虫通用(Schistosoma spp.) 会引起血吸虫病，该病主要通过皮肤，黏膜与疫水接触受染。患病后，侵袭期患者可有咳嗽、胸痛、偶见痰中带血丝等症状，急性期临床上常会出现发热、痢疾样大便且带血和黏液、肝脾大、咳嗽、胸痛，血痰等症状，慢性期多因急性期未曾发现，未治疗或治疗不*，或多次少量重复感染等原因，逐渐发展而成，晚期病人极度消瘦，出现腹水、巨脾，腹壁静脉怒张等晚期严重症状。感染该病对人体健康造成严重损害，因此快速检测血吸虫通用具有重要意义。荧光定量PCR是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测血吸虫通用的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。
2.特异性高，引物是根据人血吸虫通用高度保守区设计,不会扩增其他细菌和微生物。
3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。
4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。
5. 一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。
6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。
血吸虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 2×PCR MagicMix | 500μL（棕色） |
试剂二 | 荧光 PCR 模板稀释液 | 1 mL（黄盖） |
试剂三 | 血吸虫通用PCR引物 | 100 μL（白盖） |
试剂四 | 血吸虫通用阳性对照 (1×10E8拷贝/μL) | 50μL（红盖） |
| 试剂五 | 天净沙核酸释放剂试用装 | 20 次（1mL，绿盖）） |
试剂六 | 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法 一、制备标准曲线样品（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
2.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR模板稀释液，用带芯枪头，下同）。
3.在7号管中加入5 μL 阳性对照（其浓度为1×10E8拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
7.用自选方法纯化样品的DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8.如果有N个样品，则需要进行N+2个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。如果用本试剂盒自带的天净沙DNA释放剂试用装。则按下面步骤操作：
9.配制溶液A工作液。以配制1mL工作液（足够10个样品）为例：在一干净塑料管中加入10μL溶液A成分一，20μL溶液A成分二和970μL超纯水，充分混合均匀即可。溶液A工作液可室温放置，但在一周内用完，不要长期放置。一次检测一个样品需要100μL溶液A工作液，1mL工作液足够10个样品。如果待测样品数量为其他数字，配制的溶液A工作液的体积需要做相应的调整。
10.在标记好的N+2个离心管中，加入1-5mg（半粒芝麻大小）固体待测样品或5μL液体待测样品。在样品制备阳性对照中加入5μL阳性对照，在样品制备阴性对照中加入5μL水。
11.在每个管中加入100 μL溶液A工作液，确保固体样品被溶液淹埋，如果是液体样品则震荡混匀。
12.95℃保温10分钟。
13.待冷却到常温后加入10μL溶液B并混匀得DNA释放液。每个样品得到的DNA释放液足够进行50-100次PCR。
三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
14.如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
15.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加）：
成分 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照管 | 标准曲线 样品管（2-7管） |
2×qPCR MagicMix （棕色管） | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
血吸虫通用 PCR引物混合液（白盖） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
自备10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
待测样品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号） | 不加 | 不加 | 各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…） |
16.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。
四、荧光定量PCR反应参数
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 94℃ | 5 min |
PCR反应 （35个循环） | 94℃ | 0.5 min |
50℃ | 0.5 min（采集SYBR通道的荧光信号） | |
72℃ | 0.5 min | |
后延伸 | 72℃ |
|
五、数据处理
17.设定60℃-96℃范围的融解曲线分析，排除假阳性。
18.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
19.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
五、电泳检测
如果有必要电泳确认，可取10-20 μL PCR产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产物的大小为400 bp。
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