绵羊痘病毒染料法荧光定量PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。
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品牌 | 其他品牌 | 货号 | XY-0663 |
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规格 | 50T | 供货周期 | 一周 |
主要用途 | 荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。 | 应用领域 | 医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业 |
绵羊痘病毒染料法荧光定量PCR试剂盒
Sheeppox Virus(SPPV)
产品及特点
绵羊痘病毒(Sheeppox Virus,SPPV)会引起绵羊痘,是一种接触性传染病,呈流行性。它的特征是在全身皮肤、有时也在粘膜上出现典型的痘疹,病羊发热并有较高的死亡率,大多数绵羊生产国均有流行。病羊体温升高,食欲减少,精神不振,结膜潮红,有浆液或脓性分泌物从鼻孔流出,呼吸和脉搏增速,约经1-4天后发痘,痘疹多发生于皮肤少毛部分,如腿周围、唇、鼻、颊、四肢和尾内侧、乳房、和包皮上。该病毒的感染对养殖业有较大的影响,因此绵羊痘病毒的快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用,为此本公司开发了简单快捷的绵羊痘病毒染料法荧光定量PCR检测试剂盒,它具有下列特点:
1.即开即用,用户只需要提供病毒样品。
2.根据绵羊痘病毒保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。
3.灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4.一管式荧光定量PCR检测,避免后续污染。
5.本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
6.本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。
绵羊痘病毒染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 2×PCR MagicMix | 500μL(棕色) |
试剂二 | 荧光 PCR 模板稀释液 | 1 mL(黄盖) |
试剂三 | 绵羊痘病毒PCR 引物混 合液 | 100 μL(白盖) |
试剂四 | 绵羊痘病毒PCR 阳性对 照(1×10E8 拷贝/μL) | 50μL(红盖) |
试剂五 | DNA病毒裂解液(试用装) | 15次(9 mL) |
试剂六 | 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法
一、稀释 PCR 阳性对照(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)
1. 注意:由于阳性对照浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千 万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病 原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA 段作为阳 性对照。
2. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得), 充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分 震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
8. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照), 一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL PCR 阳性对照的 10000 倍稀释 的(稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝,可以将 10μL 原 液加入到 990μL 自备 TE 溶液中,充分混匀,此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此 稀释液加入到 990μL 自备 TE 溶液中,充分混匀,此为 10000 倍稀释液)再加 上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取 决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。
9. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼 容。
三、设置 qPCR 反应(20 μL 体系,在样品制备室进行)
10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上 步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线。如果做定性 分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用 第 4 号阳性对照稀释液,浓度为 14810 拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤, 定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个,其余不变。
11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕 后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加):
成分 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照管 | PCR阳性 对照管(2-7管) |
2×qPCR MagicMix (棕色管) | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
绵羊痘病毒PCR 引物混合液(白盖) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
自备10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2待测样品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第7步所得PCR阳性对照 稀释液(2-7号) | 不加 | 不加 | 各6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…) |
12.盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 92℃ | 5分钟 |
PCR反应 (30个循环) | 92℃ | 60 秒 |
58℃ | 60 秒 | |
72℃ | 60 秒 |
13.数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时,大吸收光谱在471 nm,结合DNA时的大吸收光谱在500 nm,大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。
四、数据处理
14.如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。
15.如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。
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