溶藻弧菌染料法荧光定量PCR试剂盒

溶藻弧菌染料法荧光定量PCR试剂盒

Vibrio alginolyticus

产品及特点

巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）是一种疱疹病毒组 DNA 病毒。亦称细
胞包涵体病毒，由于感染的细胞肿大，并具有巨大的核内包涵体。巨细胞病毒分布广泛，其他动物皆可遭受感染，引起以生殖泌尿系统，中枢神经系统和肝脏疾患为主的各系统感染，从轻微无症状感染直到严重缺陷或死亡。对于孕妇或有慢性消耗性疾病、免疫力低下等患者要注意保护。本公司开发巨细胞病毒染料法荧光定量PCR试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。

2. 特异性高，引物是根据鹦鹉热衣原体高度保守区设计,不会扩增其他微生物。

3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。

4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。

5. 一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。

6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。

溶藻弧菌染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂   样品 DNA。

使用方法 一、稀释PCR阳性对照（以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）
1.注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA段作为阳性对照。
2.标记6个离心管，分别为7，6，5，4，3，2。
3.用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4.在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5.换枪头，在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7.重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
8.如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL PCR阳性对照的10000倍稀释的（稀释后浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝，可以将10μL原液加入到990μL 自备TE溶液中，充分混匀，此为100倍稀释液。再取10μL此稀释液加入到990μL 自备TE溶液中，充分混匀，此为10000倍稀释液）再加上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品DNA。
9.用自选方法纯化N+2个样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼容。
三、设置qPCR反应（20 μL体系，在样品制备室进行）
10.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号阳性对照稀释液，浓度为14810拷贝/μL）。下面只描述定量分析的步骤，定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个，其余不变。
11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加）：

12.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR（具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化）。

四、数据处理
13.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品cDNA浓度的log值，再推算出其浓度。
14如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于36。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于36则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-36之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于36则为阴性，如果小于35，则为阳性