西尼罗病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。
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品牌 | 其他品牌 | 货号 | XY-0751 |
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规格 | 50T | 供货周期 | 一周 |
主要用途 | 荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。 | 应用领域 | 医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业 |
西尼罗病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒
West Nile Virus(WNV)
产品及特点
西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)是一种RNA病毒,西尼罗河病毒感染的潜伏期一般为3~12天。绝大多数为隐性感染,不出现任何症状,少数人表现为西尼罗河热,病人出现发热、头疼、肌肉疼痛、恶心、呕吐、皮疹、淋巴结肿大等类似感冒症状,极少数人感染后表现为西尼罗河病毒性脑炎、脑膜脑炎和脑膜炎,因此快速准确鉴定对该病的预防和检疫有着重要作用。本产品基于PCR原理开发。它具有下列特点:
1.一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。
2.根据西尼罗病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。
3.基于染料法qRT-PCR检测,灵敏度比常规RT-PCR高10-100倍,可以达到至少1000拷贝/反应。
4.使用一管式qRT-PCR技术,RT和PCR两步在一个试管内完成,不需要中间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。
5.本产品足够50次30μL体系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。
西尼罗病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分
编号 | 成 份 | 规格 |
试剂一 | 2×qRT-PCR 缓冲液 | 500 μL(棕色管) |
试剂二 | 10×qRT-PCR酶混合液 | 100 μL(红盖) |
试剂三 | ROX染料I | 50 μL(棕色管) |
试剂四 | ROX染料II | 50 μL(棕色管) |
试剂五 | 荧光PCR模板稀释液 | 1mL(亮黄盖) |
试剂六 | 西尼罗病毒RT-PCR引物混合液 | 100 μL(白盖) |
试剂七 | 西尼罗病毒RT-PCR阳性对照 (1×10E8拷贝/μL) | 50 μL(黄盖) |
试剂八 | 天净沙核酸释放剂试用装 | 20次(1mL,绿盖) |
试剂九 | 使用手册 | 1份 |
运输及保存 低温运输、-20℃保存(阳性对照分开放置),有效期一年。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法 一、稀释阳性对照(以10E2-10E7这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原。
1.标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR模板稀释液,用带芯枪头,下同)。
2.在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
3.换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
4.换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品RNA的制备
5.如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的阳性对照梯度稀释液中的第4号(浓度为1×10E4拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。
6.用自选方法纯化N+2个样品的RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。
三、设置RT-PCR反应(20μL体系,在样品制备室进行)
7.如果做定量分析并且只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做1次重复,则标记N+4个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照(用水做模板),1个用于PCR阳性对照(用第4号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析的步骤,定性分析只是把6个标曲反应缩减成1个,其余不变。
8.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后后加):
成分 | N+2个制备所得样品 | RT-PCR阴性对照 | RT-PCR阳性 对照(2-7管) |
2×qRT-PCR 缓冲液 | 10μL | 10μL | 各10μL |
西尼罗病毒RT-PCR 引物混合液 | 2μL | 2μL | 各2μL |
50×ROX (见注) | 0.4μL | 0.4μL | 各0.4μL |
样品制备所得RNA模板(来于第8步) | 5.6μL | 不加 | 不加 |
稀释所得6个阳性对照(来于第6步) | 不加 | 不加 | 各5.6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…) |
10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
9.上机后按下面参数进行RT-PCR(参数可能会因仪器不同而需优化)。
过程 | 温度 | 时间 |
RT(逆转录) | 50℃ | 15-30分钟 |
预变性 | 94℃ | 2分钟 |
RT - PCR反应 (30个循环) | 95℃ | 15 秒 |
60℃ | 15 秒(采集FAM通道的荧光信号) | |
72℃ | 15 秒 | |
按仪器预设程序进行溶解曲线分析 |
四、数据处理
10.如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值,再推算出其浓度。
11.如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。
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