沃尔巴克氏菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒，根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛，可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在，主要侵犯外胚层发育而成的组织，例如：皮肤、粘膜和神经组织。
产品型号：50次厂商性质：生产厂家更新时间：2020-08-17访 问 量：293
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| 品牌 | 其他品牌 | 货号 | XY-0755 |
|---|---|---|---|
| 规格 | 50T | 供货周期 | 一周 |
| 主要用途 | 荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。 | 应用领域 | 医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业 |
沃尔巴克氏菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒
Wolbachia spp.
产品及特点
沃尔巴克氏菌(Wolbachia spp.)为革兰氏阴性菌，又称为沃尔巴克氏体，属 于变形菌纲 Proteobacteria 的 α 亚门，立克次氏体科乌巴克体族乌巴克体属中 的一种，1924 年由 Hertig 和 Wolbach 在尖音库蚊 Culexpipiens 的生殖组织 里*被发现。沃尔巴克氏菌是自然界分布为广泛的一种共生菌，在鞘翅目、 双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目、直翅目和啮目等 10 多个目的 150 万一 500 万种昆虫中都有共生。沃尔巴克氏菌感染昆虫和其它节肢动物后，会导 致昆虫和其他节肢动物无法产生雄性后代。21 世纪初，对沃尔巴克氏菌的研究 成为热点。科学家们在积极寻找控制沃尔巴克氏菌的新方法或开发消灭沃尔巴克 氏菌的新药物，原因在于一旦控制或消灭沃尔巴克氏菌则有可能消除或抑制病原 性宿主对人类、禽畜和作物造成的伤害。因此快速检测沃尔巴克氏菌具有重要意 义。荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定 量 PCR 技术为基础开发的专门检测沃尔巴克氏菌的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。
2. 特异性高，引物是根据人沃尔巴克氏菌高度保守区设计,不会扩增其他细菌和 微生物。
3. 引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。
4. 提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。
5. 一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。
6. 本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。
沃尔巴克氏菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 2×PCR MagicMix | 500μL（棕色） |
试剂二 | 荧光 PCR 模板稀释液 | 1 mL（黄盖） |
试剂三 | 沃尔巴克氏菌 PCR 引物 | 100 μL（白盖） |
试剂四 | 沃尔巴克氏菌阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) | 50μL（红盖） |
| 试剂五 | 天净沙核酸释放剂试用装 | 50 次（试用装） |
试剂六 | 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂 样品 DNA。
使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液，用带芯枪头， 下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 上步制备的标准曲 线样品的第 4 号（浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝）或 第 5 号（浓度为 1×10E5 拷贝/μL，10μL 相当于 10 万拷贝）再加上一定 量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。如果每次制备需要 200μL 样品，则 PC 和 NC 的体积也必须是 200μL。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数细菌 DNA 提取试剂 盒兼容。
三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做 2-3 次重复，则反应设置数量相应增加 2 或 3 倍。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后后加）：
成分 | 样品管 N+2 个 | PCR 阴性 对照管 | 标准曲线 样品管（2-7 管） |
2×qPCR MagicMix （棕色管） | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
沃尔巴克氏菌 PCR 引 物混合液（白盖） | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自备 10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
待测样品 DNA 模板 | 6 μL |
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第 7 步所得 PCR 阳性对照 稀释液（2-7 号） |
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| 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…） |
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同 而自行优化）。
四、荧光定量 PCR 反应参数
过程 | 温度 | 时间 |
| 预热 | 94℃ | 5 min |
预变性 | 94℃ | 0.5 min |
PCR 反应 （40 个循环） | 50℃ | 0.5 min（采集 SYBR 通道的 荧光信号） |
72℃ | 0.5 min | |
| 后延伸 | 72℃ | 10 min |
五、数据处理
12. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待 测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓 度。
五、电泳检测
13. 如果有必要电泳确认，可取 10-20 uL PCR 产物直接在琼脂糖凝胶上电泳产 物的大小为 400 bp。
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