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芽孢杆菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒

型    号:50次
所属分类:PCR-染料法
报    价: 市场价:
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芽孢杆菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。

芽孢杆菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒产品概述:

芽孢杆菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒

Bacillus spp.

产品及特点

芽孢杆菌(Bacillus spp.)细菌的一科,能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌。包 括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。它们对 外界有害因子抵抗力强,分布广,存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。本公司 开发芽孢杆菌通用染料法荧光定量 PCR 试剂盒,它具有下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供 DNA 模板。

2. 引物根据芽孢杆菌专一区设计,特异性高。

3. 荧光定量 PCR 检测,比常规 PCR 更加灵敏。

4. 一管式闭管操作,降低了交叉污染。

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

6. 本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。

芽孢杆菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

 

编号

成分

规格

试剂一

2×PCR MagicMix

0.5 mL(棕色)

试剂二

荧光 PCR 模板稀释液

1 mL(黄盖)

试剂三

芽孢杆菌通用染料法 qPCR 引 物混合液

100 μL(白盖)

试剂四

芽孢杆菌通用染料法 qPCR 阳 性对照(1×10E8 拷贝/μL)

50 μL(黄盖)

试剂

使用手册

1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存,有效期一年。

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 一、稀释 PCR 阳性对照(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)

1. 注意:由于阳性对照浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千 万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病 原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的 DNA 段作为阳 性对照。

2. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液(用带芯枪头,下同)。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得), 充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中,充分 震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备 8. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性对照), 一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL PCR 阳性对照的 10000 倍稀释 的(稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝,可以将 10μL 原 液加入到 990μL 自备 TE 溶液中,充分混匀,此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此 稀释液加入到 990μL 自备 TE 溶液中,充分混匀,此为 10000 倍稀释液)再加 上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品体积多少取 决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。

9. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼 容。

三、设置 qPCR 反应(20 μL 体系,在样品制备室进行)

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上 步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线。如果做定性 分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用 第 4 号阳性对照稀释液,浓度为 14810 拷贝/μL)。下面只描述定量分析的步骤, 定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个,其余不变。

11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕 后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加):

成分

样品管 N+2 个

PCR 阴性 对照管

PCR 阳性 对照管(2-7 管)

2×qPCR MagicMix 

10 μL

10 μL

各 10 μL

芽孢杆菌通用染料法 qPCR 引物混合液

2 μL

2 μL

各 2 μL

自备 10×ROX (见注)

2 μL

2 μL

各 2 μL

N+2 个待测样品 DNA 模板 

6 μL

 

 

自备超纯水 6 μL 

第 7 步所得标准曲线样 品稀释液(2-7 号)

 

 

各 6μL(2 号样到 2 号管,3 号样到 3 号管…)

12. 盖上盖子后上机,按下面参数进行 PCR(具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行 优化)。

过程

温度

时间

 预变性

95℃

5 min

 

PCR 反应

(40 个循环

95℃

15 sec

60℃

1 min(采集 SYBR 通道的荧 光信号) 

按仪器预设程序进行熔解曲线分析

四、数据处理

13. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵 轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 cDNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

14. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等 于 34。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 34 则为阴性,如果小于或等于 34 则为 阳性。

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