肠侵袭性大肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒，根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛，可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在，主要侵犯外胚层发育而成的组织，例如：皮肤、粘膜和神经组织。
产品型号：50次厂商性质：生产厂家更新时间：2020-07-30访 问 量：483
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| 品牌 | 其他品牌 | 货号 | XY-0268 |
|---|---|---|---|
| 规格 | 50T | 供货周期 | 一周 |
| 主要用途 | 荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。 | 应用领域 | 医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业 |
肠侵袭性大肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒
Enterinvasive E.coli(EIEC)
产品及特点
肠侵袭性大肠杆菌（Enterinvasive E.coli, EIEC）是引起较大儿童和成年 人腹泻的重要病原菌，能穿入上皮细胞内，使细胞蛋白溶解并在其中生长繁殖， 使粘膜刷状缘受损，局部发生溃疡甚至出血，所以临床大便表现似痢疾。本产品 就是为此目的根据 PCR 原理开发的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据肠侵袭性大肠杆菌高度保守区设计，，不会跟其他病毒株 DNA 发生交叉 反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
肠侵袭性大肠杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL（本色盖） |
试剂二 | 荧光 PCR 模板稀释液 | 1 mL（黄盖） |
试剂三 | 肠侵袭性大肠杆菌探针法 qPCR 引物混合液 | 100 μL（白盖） |
试剂四 | 肠侵袭性大肠杆菌 qPCR 探 针 | 50 μL（棕色管） |
| 试剂五 | 肠侵袭性大肠杆菌探针法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷 贝/μL) | 50 μL（黄盖） |
| 试剂六 | 天净沙核酸释放剂（试用装） | 20 次（1mL，绿盖） |
试剂七 | 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输、-20℃保存，有效期一年。
自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法 一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液，用带芯枪头， 下同）。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震 荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品，好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性 对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。
三、Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用 水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后后加）：
成分 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照管 | 标准曲线 样品管（2-7管） |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
肠侵袭性大肠杆菌qPCR探针 | 1 μL | 1 μL | 各1 μL |
肠侵袭性大肠杆菌探针法qPCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2个待测DNA模板 | 7 μL | 不加 | 不加 |
超纯水 | 不加 | 7 μL | 不加 |
第7步所得标准曲线样品稀释液（2-7号） | 不加 | 不加 | 各7 μL（2号样到2号管，3号样到3号管…） |
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 10 min |
PCR反应 （40个循环） | 95℃ | 15sec |
60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的荧 光信号） |
四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值 为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。
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