马疱疹病毒1型染料法荧光定量PCR试剂盒

马疱疹病毒1型染料法荧光定量PCR试剂盒

Equine Herpesvirus 1 (EHV-1)

产品及特点

疱疹病毒（herpes virus）是一群有包膜的 DNA 病毒，生物学特性相似，归类为 疱疹病毒科（Herpesviridae）。其感染宿主广泛，主要侵害皮肤、黏膜以及神经组 织，严重影响着人及其他动物的健康。马可能感染多种疱疹病毒。常见的与感冒病 毒相似，易致呼吸困难。而金溪马术中心发现的是罕见却严重的马疱疹病毒 1 型 （EHV-1）。它会影响中枢神经系统，可引起步态不稳、无法排尿、尾部下垂及无法 站立。年龄偏大、易感的马匹可能无法存活。马疱疹病毒 1 型(EHV-1)经感染甚至重 复感染马后产生的免疫力是短期的,且马在一生中可以受到几次感染。因此灵敏快捷的 诊断产品具有重要的意义。本公司产品开发马疱疹病毒 1 型染料法荧光定量 PCR 试 剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供病毒 DNA 模板。

2. 引物根据马疱疹病毒 1 型专一区设计，特异性高。

3. 荧光定量 PCR 检测，比常规 PCR 更加灵敏。

4. 一管式闭管操作，降低了交叉污染。

5. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。

马疱疹病毒1型染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂   样品 DNA。

使用方法 一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。 由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液，用带芯枪头， 下同）。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提 供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。

8. 如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备 阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。

三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

9. 如果进行定量分析，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定 性分析，则 6 个标准曲线样品只选一个做（可以选 4 号，其余样品不变）。 以下只介绍定量分析的反应设置。

10. 在标记管中按下表加入各成分：

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同 而自行优化）。

四、荧光定量 PCR 反应参数

五、数据处理

12. 设定 60℃-96℃范围的熔解曲线分析，排除假阳性。

13. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

14. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 32。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 32 则为阴性，如果小 于或等于 30 则为阳性。如果在 30-32 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 32 则为阴性，如果小于 30，则为阳性。