马鼻肺炎病毒探针法荧光定量PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。
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品牌 | 其他品牌 | 货号 | XY-0294 |
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规格 | 50T | 供货周期 | 一周 |
主要用途 | 荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。 | 应用领域 | 医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业 |
马鼻肺炎病毒探针法荧光定量PCR试剂盒
Equine Rhinopneumonitis Virus(ERV)
产品及特点
马鼻肺炎病毒(Equine Rhinopneumonitis Virus,ERV)会引起马鼻肺炎, 又名马病毒性流产,是马的一种急性发热性传染病,在自然条件下只感染马属动 物。病马和康复后的带毒马是传染源,主要经呼吸道传染,消化道及交配也可传 染,可呈地方性流行,多发生于秋冬和早春。妊娠母马感染本病时,易发生流产; 幼驹发病初期高热,体温高达 39.5-41℃,可持续 2-7 天,同时可见鼻粘膜充血 并流出浆液性鼻液,颌下淋巴结肿大,食欲稍减,体温下降后可恢复正常,若发 病后调教或劳役过度,易引起细菌继发感染,发生肺炎和肠炎等,造成死亡。该 病毒容易给马场养殖业造成较大经济损失,因此马鼻肺炎病毒的快速准确鉴定对 该病的预防和检疫有着重要作用,本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基 础开发的专门检测马鼻肺炎病毒的试剂盒,它具有下列特点:
1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。
3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。
4. 特异性高,引物是根据马鼻肺炎病毒高度保守区设计,不会跟其他病毒 DNA 发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
马鼻肺炎病毒探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分
编号 | 成分 | 规格 |
试剂一 | 2×Probe qPCR MagicMix | 500 μL(本色盖) |
试剂二 | 荧光 PCR 模板稀释液 | 1 mL(黄盖) |
试剂三 | 马鼻肺炎病毒探针法 qPCR 引物混合液 | 100 μL(白盖) |
试剂四 | 马鼻肺炎病毒 qPCR 探针 | 50 μL(棕色管) |
试剂五 | 马鼻肺炎病毒探针法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) | 50 μL(黄盖) |
试剂六 | 使用手册 | 1 份 |
运输及保存 低温运输、-20℃保存,有效期一年。
自备试剂 DNA 模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。
使用方法 一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。
1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。
2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液,用带芯枪头, 下同)。
3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7. 如果有 N 个样品,好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。
8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。
三、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后后加):
成分 | 样品管 N+2个 | PCR阴性对照管 | 标准曲线 样品管(2-7管) |
2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
马鼻肺炎病毒qPCR探针 | 1 μL | 1 μL | 各1 μL |
马鼻肺炎病毒探针法qPCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2个待测DNA模板 | 7 μL | 不加 | 不加 |
超纯水 | 不加 | 7 μL | 不加 |
第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号) | 不加 | 不加 | 各7 μL(2号样到2号管,3号样到3号管…) |
11.盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR:
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 3 min |
PCR反应 (40个循环) | 95℃ | 15sec |
60℃ | 1 min(采集 FAM 通道的荧 光信号) |
四、数据处理
12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值 为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。
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