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原代肝细胞培养方法总结News

原代肝细胞培养方法总结
发布时间:2017-06-22 点击次数:2052次

原代肝细胞培养方法总结

1、肝细胞培养液的组成(以100ml培养液为例):
DMEM90ml,10%胎牛血清10ml,肝细胞生长因子1-2ug,双抗(100乘)1ml,胰岛素500U/L、地塞米松0.4mg/L
关于培养液添加内容的解释:
肝细胞培养液中是否要添加肝细胞生长因子
重组人肝细胞生长因子(r—hHGF)是zui强的促肝细胞分裂剂,在一定剂量范围内,r—hHGF与肝细胞DNA的合成有明显的量效关系。
肝细胞生长因子的剂量问题:1ng/ml r-hHGF即可引起DNA合成显著增加;10ng/ml时DNA合成效应zui大,继续增加r-hHGF的剂量会出现抑制效应。
该实验结果可观察到,r-hHGF5ng/ml的刺激效应与10ng/ml的相差无几。这提示我们,为了节省试剂,在以后的实验中可采用5ng/ml的剂量。Strain等研究证明 ],从人血浆中提取并纯化的hHGF刺激原代培养大鼠肝细胞合成DNA的半zui大剂量为1—2 ng/ml(1O一20 pmol/L)
肝细胞生长因子作用时间的问题;表现为r-hHGF作用24小时,DNA 合成量明显高于对照组(P<0.01),48小时作用达zui高(P<0.001),随后开始下降,至96小时下降到相当于24小时的水平。(肝细胞生长因子刺激大鼠离体肝细胞DNA合成的剂量一与时间一效应)
青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml:防止污染
胰岛素10-8mol/L,地塞米松10-6mol/L促进贴壁
组织块法肝细胞分离:
采用胰酶、胶原酶两步消化法和低速多次离心法进行肝细胞分离。将出生后第3天的SD大鼠断头处死放入750ml/L乙醇中消毒10min,无菌采取肝,置冰冷PBS中,撕去肝包膜,剪碎后加入0.5mg/L的胰酶中37℃振荡消化20min,弃去上清后,再用2mg/L的IV型胶原酶37℃振荡消化20min,用含10% 胎牛血清的DMEM-HG终止消化,吹打2min,静置使肝组织块沉于消化瓶的底部,取上清收集细胞悬液,以800r/min离心5 min,弃上清,加入含10% 胎牛血清的DMEM-HG培养液,调整细胞浓度以5×10/ml接种于50ml培养瓶内,37"C、5 %C02、饱和湿度静置培养。用200目孔径网筛过滤,细胞悬液在4℃条件下800r/min离心3min,反复离心3次。沉积的细胞用含100ml/L胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度为5*105/ml,台盼蓝染色测定肝细胞活力。将调整好密度的细胞接种在胶原包被的培养板中,培养24小时后换液,去掉红细胞。采用过碘酸-雪夫反应鉴定肝细胞。
2.取肝细胞注意事项
取大鼠肝脏细胞前需要禁食12h
非灌流分离肝细胞法,该法直接将离体肝脏置于冷的培养基中,切碎,加入溶解酶破换肝细胞间连结,再经过振动、沉淀,zui后在上清液中得到游离的肝细胞。(游离肝细胞培养技术在肝脏毒理学研究中的应用)
洗涤液D-hanks液,用眼科剪剪成1mm3左右的碎块,使其成糊状。
3、肝细胞培养过程中造成肝细胞损伤的问题
原代培养的大鼠肝细胞的代谢功能较其他细胞更为敏感,本实验中由于肝细胞分离时细胞膜完整性的损伤,细胞需要在体外逐渐的修复,在培养第3天细胞活力(MTT实验A值zui大)达到高峰,合成和分泌功能完好,LDH漏出也较低,细胞达到*状态,与其他研究结果一致。(全反式视黄酸对大鼠原代肝细胞铁代谢的影响)
4、台盼蓝染色的浓度
0.4的台盼蓝,达90%以上用于实验(两步灌流法)(肝细胞生长因子刺激大鼠离体肝细胞DNA合成的剂量一与时间一效应)
 


Trypan blue (台盘兰)排斥实验:
细胞悬液0.1ml加入0.4% Trypan blue生理盐水溶液0.1ml,混匀后滴在血球记数板上。存活率=不着色细胞数/细胞总数X100%


5、取肝细胞注意事项
取大鼠肝脏细胞前需要禁食12h
非灌流分离肝细胞法,该法直接将离体肝脏置于冷的培养基中,切碎,加入溶解酶破换肝细胞间连结,再经过振动、沉淀,zui后在上清液中得到游离的肝细胞。(游离肝细胞培养技术在肝脏毒理学研究中的应用)
洗涤液D-hanks液,用眼科剪剪成1mm3左右的碎块,使其成糊状。
6、肝细胞培养过程中造成肝细胞损伤的问题
原代培养的大鼠肝细胞的代谢功能较其他细胞更为敏感,本实验中由于肝细胞分离时细胞膜完整性的损伤,细胞需要在体外逐渐的修复,在培养第3天细胞活力(MTT实验A值zui大)达到高峰,合成和分泌功能完好,LDH漏出也较低,细胞达到*状态,与其他研究结果一致。(全反式视黄酸对大鼠原代肝细胞铁代谢的影响)
7、Pereol1分离液:Pereol1分离液以9份Percoll原液,加入1份10 X PBS,制成缓冲的Percoll液,再用1 X PBS调整Percoll液密度为1.08—1.09 kg/L。若肝细胞的活率在90%以下,则加用Percoll细胞分离液进一步纯化。8 mL肝细胞悬液悬浮于密度为1.08—1.09 kg/L的20 mL Percoll液上,5 000 r/min离心5 min,弃上清,PBS清洗肝细胞1次,500 r/min,3 min。
肝细胞的接种 活力在90% 以上的肝细胞按1 X l05密度接种两组6孔板,每孔加入3 mL Hepa.toZYME—SFM肝细胞培养液,于37℃ 、5%co2条件下培养。培养4—6 h待肝细胞贴壁后即更换培养液,其后每3 d换液1次。(长期培养的大鼠原代肝细胞功能和形态学观察)
8.(1)培养瓶紫外过夜,高压后的1×PBS 10ml备用
(2)计算胶原溶液浓度:查文献得胶原浓度为10μg/cm2(储存浓度为4mg/ml),一般中等大小的培养瓶为25cm2,计算[(10×1/1000 mg/cm2)×25cm2]/4mg/ml可得出每个培养瓶需要的胶原量
(3)先在高压后15ml离心管内加入5ml 1×PBS,再用枪吸取计算好的胶原用量,注入PBS里,混匀
(4)将配好的胶原溶液缓缓注入培养瓶中,将培养瓶水平放在超净台里,可用紫外照,15-30min后,将PBS贴壁吸出,尽量吸干净,再将培养瓶放入超净台里照紫外,等胶原干后即可使用。
(5)如果放在超净台里保存,一周内仍可有效。注:1、所有操作均在超净台里无菌操作2、胶原为collage type I(Upstate)液态浓度为4mg/ml,无菌。3、PBS新鲜配置,高压后放在超镜台里冷却至室温
(6)胶原一定要充分混匀,否则铺板时凸凹不平
(7)胶原包被后,不要用紫外线照,会破坏胶原结构,注意无菌操作即可。2。使用前,用温热的不含血清的培养基洗一次后,再用。


胶原包被后应该晾干,因为胶原一般是用0.01%醋酸配制,如果包被后没有自然晾干,会使培养基变酸。自然晾干后可以保证胶原完全吸附在培养皿或培养瓶上,而且多余的醋酸可以挥发,不会影响培养基的PH值。别忘了加分

我用培养皿,包被后超净台内开盖开紫外灯~


胶原用三蒸水溶即可,4mg用16ml溶,终浓度250ug/ml,4度保存用时每10ml培养液加0.1ml,配成2.5ug/ml含胶原培养液来包被包被后敞开在紫外灯下照射一小时即可.
9.肝细胞纯化采用差速离心法:800转,4℃,3min
10.鉴定我采用的是糖原染色和免疫荧光(ck18)

 


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