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6、24、96孔板接种和换液问题

更新时间:2023-05-31      浏览次数:2089

6、24、96孔板接种和换液问题

细胞培养板培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等,孔的底部可以选择平的、圆的,或锥形的,这取决于细胞类型和下游应用。对于传统的2D细胞培养(如HeLa或MDCK细胞),特别是需要对培养物进行成像或分光光度测定,通常选平底(F-bottom)。对于不存在接触抑制的细胞,弧形底(C-bottom)也不错。圆底(U-bottom)适合悬浮培养(如球体细胞培养),因为圆的表面让细胞难以附着和生长。而锥形底很少用于细胞培养实验,但在细胞沉淀时可能有用。

以下主要为大家介绍6、24、96孔板接种和换液问题。


6孔板接种和换液问题

问题1:细胞传代很正常,但一种到六孔板里(不管加药和对照),总有两三个孔(随机)细胞长得不好,很小,像破碎了。有人遇到过这种情况吗?到底是啥原因呢?

可能跟加液的温度有关。如果细胞刚刚拿出来换液加液,培养基也是从4度冰箱拿出来不久,很容

易细胞就会冻死了。建议最好把培养基先在培养箱里边孵育15min先。

另外,跟细胞的生长状态也有关。加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。保证细胞状态良好。

或者放在37度水浴锅里孵育也可以,或者是培养板本身的问题,再换换其他培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了,种板时的血清浓度调高试一下。


问题2:用六孔培养板接种细胞,培养24小时后更换培养基,在更换培养基之前,显微镜观察到细胞贴壁,状态非常的好,更换了培养基后,立即用显微镜观察,发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变得非常小,产生大量的碎片,而另一半的细胞一切正常,异常细胞与正常细胞之间存在一条分水岭,上半个圆是好的,下半个圆就不好,这是怎么一回事?

答:1.可以看一下是不是培养板没放水平。

    2.培养液如何,如果培养液过期,细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试一试。

    3.可能是板的问题,换一个牌子的板或换用培养瓶就没问题了。

    4.所需换液的培养板多不多,换培养基的时候如果没有注意风机的影响,特别是所需换液的培养板很多时,容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。如果如此,换液时应该逐个培养板进行,别怕浪费吸管,注意操作的效率!


24孔板接种问题

问题1:把细胞消化接种到24孔板之后,已经四天了,老是每孔的中间部分长不满,每天换液时都用PBS 清洗,第二天换液时都出现同样的情况,每孔的边缘长的很好,中央大量死细胞,也不知道是什么原因?

答:是中央长不满,还是中央有和边缘相同密度的细胞,但是大部分都是死细胞?如果是前者,也许不是技术问题,而是物理问题了。

选择孔内铺盖玻片,在玻片上种植。每次换液都用PBS洗,是必要的步骤吗?另外,也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关?

如果培养液加的太少了。由于表面张力的作用,培养板的边缘液体会向上走,造成培养液面呈现一个凹面(就像量筒的液体凹面一样),中央的细胞正好在凹面的Lowest处,培养液少,细胞的营养不够,甚至干涸掉,空气中的氧气也会造成损伤,即使有增值过来的细胞也会死掉。

另外,检查一下培养箱底部的水是否少了,如果少了,箱内的空气湿度不够,会造成培养液挥发加快,这样即使刚加的液体不少,过一段时间,由于蒸发,液体量会减少,造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度,造成渗透压过高。

个人经验认为这是物理问题:24孔板小,细胞接种进去后是很难摇均匀的,结果导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况。

至于中间较多死细胞,如果是悬浮状的话,也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞,似乎对摇均匀细胞有一定效果。

在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意,不要把培养基吸得太干,如果全部吸取,很容易造成细胞干涸,这样的话细胞会很快死亡。

同时细胞周围密而中间稀疏,大约有如下原因

1.培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。

2.细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。


问题2:细胞在接种在24孔板上时,孔的周围细胞密集,中间细胞稀少,试了很多次均如此。请问怎样操作才能使细胞分布均匀?

答:这种情况一般是种板时培养液过少,液面总是呈一凹面,如果液面过低,孔中间就基本上没什么细胞,所以种板时一定不能吝啬培养液,待贴壁后可以用比较少量的培养液处理

周围细胞稀少,中间细胞密集:这种情况一般是种板后过于晃动,特别是旋转着晃动.有人才用十字方向的晃动方法使细胞分散均匀.但本公司研究人员认为,将细胞加入孔后,用枪或移液器充分吹打混匀后就不用,也不能再晃动,甚至拿着孔板走路带来的震动都会让细胞往中间集中。

当然,无论是哪种情况,首先都需要保证细胞在种板时时均匀分布的,即种板时的细胞悬液一定要混匀。

根据细胞的特性,细胞均喜欢聚集在边缘生长,所以考虑到,还有可能是接种时的细胞密度不够,导致周边密集,中间稀疏的错觉。

另"要慢慢加样,且记得轻微旋转枪头"。加样不能太快,避免细胞在一个加样处聚集,且注意在不同的部位进行加样,即边加边活动枪头,人为使细胞趋于均匀分布。


96孔板细胞接种换液和收集细胞

问题1:用96孔培养板培养肿瘤细胞,结果细胞长得不是很理想,不是长得不均匀,就是每个孔细胞生长速度不一样。另外,镜下观察细胞轮廓很不清晰,怎么调焦距效果都不好。(板子是刚拆封的。)不知道怎么回事?

答:首先要尽可能把消化细胞消化成单个细胞(不要成团),反复吹打,掌握好时间(不同的细胞要摸索的),种细胞时要均匀的吸取,清清的吹打一遍再吸取细胞,这样也许会解决问题。

种到96孔板的细胞一定要消化成单个细胞,建议用EDTA和胰酶消化。加血清后反复吹打。细胞量尽量少一点。

提议:

1、对细胞的选择要注意,要选择状态好的细胞,密度要选分布瓶底80%为宜;

2、消化时,不要忘了用PBS(或纯的不含血清的培养基)洗一遍,加0.25%的胰酶1ml消化2-3分钟(不同的细胞有差别,要摸索),还要不时的活动,让胰酶分布到每个角落,之后倾去胰酶,加3ml培养基(加血清过于粘稠,不宜吹打,加培养基后稀释胰酶可不考虑对细胞的损伤),吹打成单个细胞;

3、接种时要注意细胞密度,多数细胞要求0.5-2的10的4次幂,这也要摸索一下(简单:就是种一个密度,如果在测指标时细胞没过多影响结果就行);

4、周边的孔不要做指标检测孔,有没有发现周边的孔的细胞2天后状态就明显不好了;

5、接种细胞调整好浓度后,要一边吹细胞悬液一边接种;

6、还有看不清细胞,注意到没有,当把培养板拿出孵箱一会,培养板盖就有一层雾,会影响观察细胞,是不是这个问题?


问题2:在96孔培养板上接种的细胞很均匀,但换液时,用枪加150ul的培养基加入每个孔内,结果在显微镜下观察周边细胞全被冲到孔中央去了,而中间的细胞层叠成致密的团块,请问这样的细胞对实验有影响吗?有其他的好办法吗? 是3T3-L1前脂肪细胞,要进行诱导分化成成熟脂肪细胞。所以每次换液总把握不好。请问有谁有这方面的经验吗?

答:我们实验室一般用机械吸引器吸引,吸引器管前面套一个20ul加样器的Tip头,效果不错,操作在无菌台内进行。Tip头剪去Tip后灭菌使用,加液时液体呈滴状滴入,就不会扰动孔底的细胞了。

建议:加液的时候沿着边轻轻的加入,动作柔和,可以避免冲动细胞;去液的时候直接甩板,方便快捷。

去液的时候不建议直接甩板,容易污染。可以剪掉tip尖,不能直接冲细胞,沿孔壁轻轻加入,液体提前在孵箱里预热10分钟,有时候液体凉也会使细胞掉下来。

在96孔板中诱导细胞换液一般采用半量换液,这样细胞就不会被冲走了,至于换液的间隔与细胞有关,如果卷得特别厉害,很可能是细胞的问题,建议更新细胞株。


问题3:细胞对胰酶和EDTA不管用.高浓度胰酶可以,但细胞存活率不高,有没有小的细胞刮匙,(或者自制刮匙的方法),可以用于96孔板?(在建细胞系,非得用96孔板)。

答:一般情况下细胞在一次性培养瓶或培养板中贴壁较紧,都不太好消化,如果建系的话最好不用刮的方法,还是消化比较好!消化时以下几点注意了吗?

消化前用D-Hanks冲洗了吗?可以冲洗2-3遍。

适当增加胰酶浓度,提高胰酶PH值到8,减少消化时间应该对细胞影响不大。消化时放入37度培养箱。

如果细胞还是消化不下来可加适量胶原酶,有的细胞对胶原酶敏感。


问题4:D-Hanks和PBS冲洗效果有何不同?在胰酶消化前一直用PBS冲洗。

答:首先,D-Hanks和PBS冲洗细胞都可以的,不过严格来说D-Hanks更好,因为胰酶是用D-Hanks溶的,所以用D-Hanks不改变胰酶的消化环境。

第二个问题,可以不用wash,加入带血清的培养基之后胰酶将没有作用,但是如果EDTA浓度太高的话就需要wash了。


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