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猪圆环病毒3型探针法荧光定量PCR试剂盒

型    号:50次
所属分类:PCR-染料法
报    价: 市场价:3290
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猪圆环病毒3型探针法荧光定量PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。

猪圆环病毒3型探针法荧光定量PCR试剂盒产品概述:

猪圆环病毒3型探针法荧光定量PCR试剂盒

Porcine Circovirus 3 (PCV-3)

产品及特点

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)在分类学上属圆环病毒科圆环病 毒属,为已知的小的动物病毒之一。病毒粒子直径 14-17nm,呈 20 面体 对称结构,无囊膜,含有共价闭合的单股环状负链 DNA,基因组大小约为 1.76kb。PCV 对外界理化因子的抵抗力相当强。PCV3 于 2016 年*在美国 报道,与母猪丘疹性皮炎、肾病综合征和流产相关。因此快速检测猪圆环病毒 3 型具有重要意义。荧光定量 PCR 是检测传染性疾病的主流技术,。本产品就是 以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测猪圆环病毒 3 型的试剂盒, 它具有下列特点:

1. 即开即用,用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化,灵敏性高。

3. 提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4. 特异性高,引物是根据猪圆环病毒 3 型高度保守区设计,不会跟其他病毒 DNA 发生交叉反应。

5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

6. 本产品只能用于科研。 

猪圆环病毒3型探针法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

编号

成分

规格

试剂一

2×Probe qPCR MagicMix

500 μL(本色盖)

试剂二

荧光 PCR 模板稀释液

1 mL(黄盖)

试剂三

猪圆环病毒 3 型探针法 qPCR 引物混合液

100 μL(白盖)

试剂四

猪圆环病毒 3 型qPCR 探针

50 μL(棕色管)

试剂五 

猪圆环病毒 3 型探针法 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷 贝/μL)

 

50 μL(黄盖)

剂六

使用手册

1 份

运输及保存 低温运输、-20℃保存,有效期一年。

自备试剂  DNA 模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。

使用方法 一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。 由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能 污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液,用带芯枪头, 下同)。

3. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震 荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

7. 如果有 N 个样品,好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 阳性对照的 10000 倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8. 用自选方法纯化样品的 DNA,本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼 容。

三、Probe qPCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个 用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用 水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模 板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。 10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后后加):

成分

样品管

N+2

PCR阴性对照管

标准曲线

样品管(2-7管)

2×Probe qPCR MagicMix

10 μL

10 μL

各10 μL

猪圆环病毒 3 型qPCR探针

1 μL

1 μL

1 μL

猪圆环病毒 3 型探针法qPCR引物混合液

2 μL

2 μL

2 μL

 N+2个待测DNA模板

7 μL

不加

不加

超纯水

不加

7 μL

不加

第7步所得标准曲线样品稀释液(2-7

不加

不加

各7 μL(2号样到2号管,3号样到3号管

11.盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR:

过程

温度

时间

预变性

95℃

3 min

PCR反应

40个循环)

95℃

15sec

60℃ 

1 min(采集 FAM 通道的荧 光信号)

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值 为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大 于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该 小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小 于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。若重复结果 Ct 值小于 40,扩增曲线有明显起峰,该样本判断为阳性,否则为阴性。 

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