猪圆环病毒通用染料法荧光定量PCR试剂盒

猪圆环病毒通用染料法荧光定量PCR试剂盒

Porcine Circovirus(PCV)

产品及特点

猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)有 PCV-1 和 PCV-2 两种型，其基因组为 单链 DNA，长度分别为 1759nt 和 1768nt，其同源性低于 80%，但基因组结构相似。 PCV-1 无致病性，广泛存在于猪体内。PCV-2 对猪具有较强的易感性，感染猪可自鼻 液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。感染病毒后的病 猪常见的症状是猪只渐进性消瘦或生长迟缓，这也是诊断所必需的临床依据，其他症 状有厌食、精神沉郁、行动迟缓、皮肤苍白、被毛蓬乱、呼吸困难，咳嗽为特征的呼吸 障碍，较少发现的症状为腹泻和中枢神经系统紊乱，一旦感染该病毒，发病率一般很低 而病死率都很高，对养猪业带来较大的经济损失，因此猪圆环病毒通用的快速准确鉴定 对该病的预防和检疫有着重要作用，为此本公司开发了简单快捷的猪圆环病毒通用染料 法荧光定量 PCR 检测试剂盒，它具有下列特点： 

1. 即开即用，用户只需要提供病毒样品。

2. 根据PCV-1和PCV-2共同的保守序列设计的专一性引物，与其他病毒无交叉反应。

3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。

4. 可以同时测出 PCV-1 和 PCV-2，但不能分型。

5. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。

6. 本试剂盒足够 50 次 20μL 反应体系的荧光定量 PCR。

7. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。 

猪圆环病毒通用染料法荧光定量PCR试剂盒规格及成分

运输及保存 低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂   样品 DNA。

使用方法 

一、稀释 PCR 阳性对照（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）

1. 注意：由于阳性对照浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千 万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病 原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的 DNA 段作为阳 性对照。

2. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

3. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 模板稀释液（用带芯枪头，下同）。

4. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

5. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)， 充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

6. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分 震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

7. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

8. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照）， 一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL PCR 阳性对照的 10000 倍稀释 的（稀释后浓度为 1×10E4 拷贝/μL，10μL 相当于 1 万拷贝，可以将 10μL 原 液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 100 倍稀释液。再取 10μL 此 稀释液加入到 990μL 自备 TE 溶液中，充分混匀，此为 10000 倍稀释液）再加 上一定量的水作为制备的阳性对照（加水后其总体积跟样品一样，样品体积多少取 决于所用试剂盒的要求）。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 DNA。

9. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取试剂盒兼 容。

三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上 步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线。如果做定性 分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用 第 4 号阳性对照稀释液，浓度为 14810 拷贝/μL）。下面只描述定量分析的步骤， 定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个，其余不变。

11. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕 后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后后加）：

12. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行 优化）。

13. 数据采集 具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合 DNA 时， 大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的大吸收光谱在 500 nm，大发射光 谱在 530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

四、数据处理

14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵 轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。

15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等 于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为 阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则 为阴性，如果小于 40，则为阳性。