培养小鼠树突状细胞攻略

培养小鼠树突状细胞攻略

1. C57Bl/6小鼠
2. 处死小鼠，75%酒精浸泡10min
3.解剖取出小鼠股骨和胫骨
4.去除骨上组织
5.冲洗骨髓腔，直至骨变白
6.收集的细胞沉淀以10000/ml细胞数接种，培养液含200U/mlrmGM-CSF和IL-4
答：
不知道U和ng之间是如何换算的呢，因为我用的是R&D的细胞因子，是以ng为单位的，是否像论坛上有战友所说的1U＝1ng呢？

答：活性单位是个效应单位，是表示生物制品的活性的，和质量单位不是简单换算关系。
有生物活性的物质，往往可杀死生物（如抗生素可杀死细菌）或促进生物增殖作用（多数细胞因子可促进细胞增殖）。在活性检测时，设定一个浓度剃度，测得zui小致死量（如：抗生素）或zui大有效量也称饱和有效量（如：某些细胞因子）的浓度，然后取中位数（即半数致死量或半数有效量）的倒数就是活性单位。如：R&D的说明书注明GM-CSF的Activity（活性）：ED50 =10 - 60 pg/mL(ED50，ED是zui大有效量，50表示50％，ED50就是半数zui大有效量）。你取其倒数，就可算出它的活性单位了，因此，它活性远超1U/ng。
生物制品的活性不是固定不变的，不同的公司、不同的批次，其活性都不同，其中R&D的细胞因子活性是比较好的，也是比较稳定的。
有几点有点改变:
1 骨髓洗出来后,可以用200目的滤膜滤一次,有些操作中的渣子,碎片会被滤掉
2 楼主好像没有测过(还是我没看到)在细胞因子刺激的细胞总共中有多少表达CD11c,楼主是否用磁珠之类的东西富集过?我原来测过,小鼠骨髓来源细胞经细胞因子GM-CSF及IL-4作用二天后,CD11C表达大约20-40%之间.并不是所有的细胞都是DC.另外,淋巴细胞不加IL-2只有IL-4也可以存活三到四天,只是状态比较差.
3 关于DC的形状:其实DC基本没有固定的形状,我见过有梭形的,三角形的,四角形,有些形状都不好说什么形,各种各样的都有.不过很少有纯圆形的,特别是贴壁后.
4 关于细胞因子用量:各个实验室有不同的搞法,我们的用量是参考国内做DCzui牛的实验室的用量(NAT IMMUNOLOGY):10ng/ml mGM-CSF和1ng/ml IL-4.效果很好.
5 关于TNF-a刺激成熟:zui常用的是TNF-a或LPS,原理有所区别:TNF是通过刺激DC表面的TNFR诱导细胞成熟,LPS则是通过刺激DC表面的TLR2,TLR4诱导DC成熟.成熟标志:CD80,CD86
6 关于抗原提呈:成熟DC也有抗原吞噬能力,只不过比未成熟DC弱.而未成熟DC亦有抗原提呈能力,只不过比成熟DC差.只是功能有偏向,并不是*没有.
流式的本质是检测细胞的分群。表现在流式的直方图（如下图）就是一个个“峰”，流式的直方图就是分析这些“峰”，而是不是抽象地、孤立地见百分比。其实百分比是是一个很不清楚的概念。我们用流式检测DC和DC的成熟程度，必须同时从两方面来看，即峰的形态和峰的位置，而不是百分比，讲百分比必须是某一细胞群占总体的百分比。任何时候离开细胞群（即图上的“峰”）的概念谈百分比，都是毫无意义的，没有一点价值。
借用丁香园某网友（具体哪位网友记不清了，不好意思）的流式图谈谈我对流式的理解。流式直方图中，横坐标表示荧光强度，即结合窄细胞上荧光抗体的多寡，也即细胞表达的抗原的多寡；纵坐标表示细胞数量。从图中可以看出，峰底比较窄，约为两个数量级（如：左图101～103，右图102.5~104.5），说明大多数细胞表达的表面分子数量比较一致，如左图中94.7%的细胞的荧光强度在101～102.8，另外，只有5.3％的细胞（少数细胞）荧光强度比较高，在102.8～103.1，峰顶在102.2左右，表明荧光强度为102.2的细胞数zui多，因为该峰有点类似正态分布，因此，102.2近似于中位数和平均数，即平均荧光强度为102.2;右图94.7%的细胞的荧光强度在102.8~104.5，5.3％的细胞（少数细胞）荧光强度比较低，在102.8以下，荧光强度为103.5的细胞数zui多。也就是说：与右图相比，左图（不成熟DC）的细胞总数中大多数细胞（94.7%）荧光强度比右图（成熟DC）低，即：右图中绝大多数细胞高表达CD11c（图A）和CD86（图B）。这就是不成熟DC和成熟DC的区别：这个窄而高的“峰”右移了，即大多数细胞的荧光强度提高了。
如果你不管流式的图形（即细胞的分群，即峰的形态和位置）情况，光讲百分比，那么左图和右图就没有差别了，都是94.7%，有何意义？
另外，讲百分比，一定要讲某一区域的细胞占总数的百分比。如上图，荧光强度为101～102.8的细胞占总数的百分比，如果取荧光强度为101～103.1d的细胞，那么就是100％。如图C，如果取荧光强度为101～103.1（如图C示）约70％，这群细胞比较一致，和103.1~105的细胞是有区别的；但如果荧光强度取101～104.5那就达到90％了；该图中就全体细胞来说分布比较分散，从101～105都有，有低表达，有高表达，从峰的形态看可分为高表达和低表达的两群。因此，离开峰的形态和位置谈百分比，可以说是毫无意义的。