内皮素受体B抑制内皮素-1引起的肝星状细胞活化

PTEN通过负调节PI3K/AKT信号通路下调内皮素受体B抑制内皮素-1引起的肝星状细胞活化

李乃树

南方医科大学

摘要：[背景]肝纤维化是继发于各种慢性肝脏疾病之后反复的创伤愈合与瘢痕修复过程,其主要病理生理学特征是细胞外基质(Extrcellular matrix,ECM)的生成与降解失衡,引起ECM的大量沉积,zui终导致肝纤维化。肝纤维化的过程可逆,不能有效控制肝纤维化必然导致肝硬化,zui终出现肝癌甚至肝功能衰竭。肝纤维化是多种细胞与细胞因子相互作用的结果,其中,肝星状细胞(hepatic slate cells, HSCs)已经被证实为引起肝纤维化的主要细胞,其活化和增殖是肝纤维化发生发展过程中的关键事件。正常情况下,HSCs处于静止状态,主要功能为储存Vitamin-A,因此也被称为储脂细胞。当肝脏受损伤时,HSCs在多种炎症反应因子的作用下被激活并转化为肌成纤维样细胞进而产生大量ECM,导致肝纤维化的发生。HSCs激活的过程受多种信号物质及信号通路的调控,但其具体机制仍未被*阐明。内皮素—1(endothelin-1,ET-1)是迄今为止发现的强的一种调节血管收缩的活性肽,在正常个体的血管张力调节过程中发挥着重要的作用。同时,ET—1也与许多疾病的发生发展密切相关,包括刺激细胞的发育和增殖、参与创伤愈合反应和组织纤维化过程。近年来,针对ET—1与肝纤维化的发生发展,尤其是HSCs的活化和增殖方面已开展了广泛的研究。正常情况下,肝组织内肝血窦内皮细胞和HSCs可以产生ET—1,在肝脏损伤的情况下,HSCs成为ET—1分泌的主要细胞,且ET—1通过作用于HSCs表面表达的ET受体(endothelinreceptor,ETR)启动HSCs的激活程序。ET—1可通过作用于HSCs上的ET—1受体,即ETAR(endothelin A receptor,ETAR)或ETBR(endothelin B receptor, ETBR),引起HSCs活化增殖和DNA合成,从而促进胶原与蛋白多糖合成增加、纤维组织增生、损伤修复的加速。众多的研究结果显示ET—1在肝纤维化的病理生理过程中发挥重要作用,但ET—1作为一种调节因子在HSCs的激活、增殖及ECM沉积的过程中作用的确切机制仍未*明确。10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源基因(phosphate and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)作为一种抑癌基因,它同时具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性,PTEN基因的缺失或突变已在包括原发性肝癌在内的许多终末期肿瘤中发现。近年来,关于PTEN的研究已经从肝脏肿瘤领域转移至肝脏非肿瘤性疾病,且已有文献报道PTEN与肝纤维化的发生发展密切相关。研究发现,纤维化肝组织中PTEN的表达下降,PTEN的表达随着肝纤维化进展而减少,且在体外环境中PTEN基因的表达与HSCs的活性及增殖能力成负相关。因此,调节PTEN在HSCs中的表达可能会影响HSCs的活化及增殖进而影响肝纤维化的进展综上所述,ET—1可以启动HSCs的活化程序,但是PTEN可以通过一定的信号通路抑制HSCs的活化过程,二者在HSCs活化过程中的作用及其机制仍有待进一步研究。[目的]为了进一步探讨ET—1及PTEN在HSCs激活方面的作用,本实验通过研究过表达PTEN的HSC-T6在外源性ET—1的刺激下所产生的效应,并应用PI3K/AKT信号通路的特异性抑制剂LY294002模拟PTEN对PI3K/AKT信号通路的阻断作用,探讨PTEN是否能够通过负调节PI3K/AKT信号通路下调ETBR的表达从而抑制ET—1引起的HSCs的激活。[方法]①、实验分组本实验按以下分组方式进行：1、P组,PTEN转染HSC-T6+ET-1组;2、V组,空载PTEN的vector转染HSC-T6+ET-1组；3、PBS+ET-1空白对照组；4、L+V组,空载PTEN的vector转染HSC-T6+ET-1+L Y294002组;5、PBS+ET-1+LY294002组。②、细胞培养大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自广东科学院,细胞培养在含10%胎台牛血清、100 IU/m青霉素、和100mg/mL链霉素的DMEM培养基中,并在37℃含5%C02的培养箱中孵育。③、细胞瞬时转染在转染前24小时,指数级生长的HSC-T6以每孔2×105的浓度接种于6孔板,待细胞铺满70%—80%的培养孔时开始转染。PTEN及空载PTEN的vector采用lipofectamine 2000,根据试剂盒说明,以zui终100nM的浓度转染进入HSC—T6,并设置PBS为空白对照组。转染稳定后各组加入10-7mol/L ET-1,12h在L+V组及L+PBS组加入50uM/L LY294002, ET-1作用48h后检测各指标的蛋白质及基因水平的表达。④、蛋白质免疫印迹法(western blot)a-SMA, ETBR及ETAR的蛋白表达水平采用western blot方法检测。经ET-1作用48h后,收集细胞样品,加入相应体积的含有1%Nonidet P-40,0.5% sodium deoxycholate,0.1%sodium dodecyl sulfate和蛋白酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液,冰上放置30 min,然后4℃,12 000 r/min离心10 min,吸出上清,得到总蛋白样品。样品蛋白质采用BCA蛋白定量试剂盒定量。调整样品蛋白质浓度使其接近,保证每个样品孔蛋白质上样量一致.蛋白质经10% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上(MILLIPORE)。PVDF膜以5%脱脂奶粉封闭1h后,加入一抗4℃过夜。在此过程中所用到的抗体a-SMA (1;1000 dilution, Santa Cruz Inc), ETBR (1:1500 dilution; Santa Cruz Inc.), ETAR (1; 1500 dilution; Santa Cruz Inc), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (1:1000 dilution; Shanghai Sangon Biotech)。取出PVDF膜,经洗涤后,再加入HRP标记的二抗(1:4000 dilution,Fude Biotech),室温下孵育1h。每步反应结束均用PBST洗涤3次,每次10 min。zui后用ECL化学发光3-5min,使用Odyssey成像系统扫膜。结果以目的蛋白与GAPDH吸光度的比值表示。⑤、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)ET-1作用后48h,采用Trizol(Invitrogen)试剂盒,按说明提取细胞总RNA。将RNA提取物1ug,逆转录为cDNA,并置于-80℃保存备用。建立20ul的PCR反应体系包括：cDNA,上下游引物、2x SYBR Green qPCR SuperMix、以及dH2O。采用LightCycler 480IISystem进行PCR扩增,建立zui适的PCR反应体系,扩增相应的产物。β-actin被用作内参。ETAR引物序列：上游5’-TCTGATGACCTC GGTCCC-3’,下游5’-GTTCATGCTGTCCTTATGGCT-3’,ETBR引物序列：上游5’-AATTACGATGGACTACAAAGGAAGTTA-3’,下游5’-GCAAGCAGAAATAGA AACTGAATAGC-3’.β-actin引物序列：上游5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’,下游5’-CAGCGGAACCGCTC ATTGCCAATGG-3’。[统计学分析]所有数据以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS21.0软件进行统计分析。组间均数差异性比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1、ET—1作用后各组各指标的变化①、ET—1作用后各组α-SMA的表达变化Western blot检测结果显示,10-7 mol/L外源性ET—1作用于各组HSC—T6后,P组α-SMA的相对表达量为(0.35±0.01),明显低于V组(0.46±0.01)及PBS组(0.46±0.01)(p<0.05),差异有统计学意义。②、ET—1作用后各组ETBR的表达变化Western blot检测结果显示,10-7mol/L外源性ET—1作用于各组HSC—T6后,ETBR蛋白的相对表达量在P组为(0.42±0.01)显著低于V组(0.85±0.01)及PBS组(0.83±0.01),(p<0.05),差异有统计学意义。qRT-PCR结果显示,10-7mol/L外源性ET—1作用于各组细胞后,ETBR mRNA的相对表达量在P组为(0.63±0.06)显著低于对照组(V组：1.61±0.13,PBS组：1.50±0.03)(p<0.05),差异有统计学意义。③、ET—1作用后各组ETAR的表达变化Western blot检测结果显示,10-7mol/L外源性ET—1作用于各组HSC—T6后,ETAR蛋白的相对表达量在P组为(0.22±0.01)与V组(0.22±0.01)及PBS组(0.22±0.01)无明显差异。qRT-PCR结果显示,10—7mol/L外源性ET—1作用于各组细胞后,ETAR mRNA的相对表达量在P组为(0.46±0.01),V组(0.46±0.01),PBS组(0.46±0.01), (p>0.05),各组之间差异无统计学意义。2、LY294002作用后各组各指标的变化①、LY294002作用后各组α-SMA的表达变化Western blot检测结果显示,LY294002作用于各组HSC-T6后,α-SMA的相对表达量在L+V组及L+PBS组为(0.34±0.01,0.34±0.01),显著低于V组及PBS组α-SMA的表达(p<0.05),但与P组α-SMA的表达无显著差异(p>0.05)。②、LY294002作用后各组ETBR的表达变化Western blot检测结果显示,LY294002作用于各组HSC-T6后,ETBR蛋白的相对表达量在L+V组及L+PBS组为(0.43±0.01,0.44±0.01),显著低于V组及PBS组(p<0.05),但与P组ETBR蛋白的相对表达无显著差异(p>0.05)。qRT一PCR结果显示,ETBR mRNA的相对表达量在L+V组及L+PBS组为(0.65±0.02,0.64±0.01),显著低于V组ETBR mRNA的表达(p<0.05),但与P组ETBR的表达无显著差异(p>0.05)。③、LY294002作用后各组ETBR的表达变化Western blot检测结果显示,LY294002作用于各组HSC-T6后,ETAR蛋白的相对表达量在L+V组及L+PBS组为(0.22±0.02,0.23±0.01),与P组、V组及PBS组ETAR蛋白的相对表达量无明显差异(p>0.05)。qRT-PCR结果显示,ETAR mRNA的相对表达量在L+V组及L+PBS组为(0.45±0.02,0.46±0.01),与P组、V组及PBS组ETAR mRNA的相对表达量无明显差异(p>0.05)。[结论]PTEN通过负调节PI3K/AKT信号通路下调ETBR而非ETAR的表达从而抑制ET—1引起的HSCs的活化。 还原

关键词：肝纤维化; 肝星状细胞; PTEN; 内皮素-1;

导师：林建华;

分类号：R575.2