揭秘CRISPR“中心法则”

2007年，来自丹尼斯克公司（一家总部位于丹麦哥本哈根的食品添加剂公司，目前被杜邦公司收购）的科学家找到了一种能增强细菌防御噬菌体能力的方法。之后2013年，四个研究团队报告了这一被称为CRISPR的系统，自此CRISPR技术红红火火的发展了起来，许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因。

近期来自蒙大拿州立大学的两位学者以“CRISPR-RNA-Guided Adaptive Immune Systems"为题，介绍了CRISPR-Cas免疫应答系统。其中Blake Wiedenheft就是当年加州大学伯克利分校Jennifer Doudna研究组成员，他们曾于2010年了Csy4核糖核酸内切酶原子水平的晶体结构模型——研究人员确定Csy4是一种存在于原核细胞的酶，它能够启动生成CRISPR衍生RNAs (crRNAs)，这种小RNA分子能够靶向并沉默侵入的病毒和质粒。

细菌和古细菌进化出了复杂的CRISPR适应性免疫系统，这一系统可以分成I-III三个类型，至少有11种不同的亚型：从I-A到I-F，从II-A到II-C，以及III-A和III-B，不过尽管有这些不同，所有的CRISPR-Cas系统都通过三个主要阶段来完成功能：采集，CRISPR RNA(crRNA) 生物合成与靶向干扰。

阶段1：外源DNA采集

外源核苷酸是通过Cas蛋白来识别的，入侵的短片段DNA（30-50个碱基对）被称为protospacers，作为间隔序列插入宿主CRISPR位点中，由重复序列隔开。对于I型和II型系统来说，protospacers来自入侵DNA中两侧出现2-5个核酸结构（PAM，protospacer adjacent motif）的区域。一般protospacers连接在CRISPR 位点的一端，并且后者通过涉及Cas1、Cas2和游离3’-hydroxyls等元件的机制，牵引序列。Protospacer的整合过程中也出现了牵引末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。

相关论文解析：

Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins

研究人员确定了其中三种anti-CRISPR蛋白：AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能机制。他们对这些蛋白进行了生物化学及体内研究，证实每一个anti-CRISPR蛋白都通过不同的机制来抑制了CRISPR–Cas的活性。有两个anti-CRISPR阻断了CRISPR–Cas复合物的DNA结合活性，但它们是通过与不同的蛋白质亚基互作，利用了空间或非空间抑制模式来做到这一点的。第三种anti-CRISPR蛋白通过结合Cas3解螺旋酶-核酸酶，阻止其招募到结合DNA的CRISPR–Cas复合物上来起作用。在体内，这一anti-CRISPR可以将CRISPR–Cas系统转变为转录遏制物，证实了一种蛋白质相互作用蛋白可以调控CRISPR–Cas活性。作者们认为，这些anti-CRISPR蛋白质不同的序列及作用机制表明了独立的进化，并预示了还存在其他的方式——蛋白质借助于它们改变了CRISPR–Cas的功能。

新研究探讨了蛋白质抑制CRISPR–Cas系统的机制。这些多样且不同的机制反映了病毒-宿主军备竞赛深层的进化根源。这些已知和尚有待发现的Anti-CRISPR，将为认识和操控CRISPR–Cas系统提供大量有价值的工具。其中一个例子就是，新研究发现AcrF3通过阻止招募Cas3将CRISPR–Cas系统转变为了一个基因调控因子。由于除了破坏外源DNA，CRISPR–Cas系统来执行着各种功能，许多重要的功能有可能是由与CRISPR–Cas元件互作，由此改变了这一系统活性的蛋白质来完成。

阶段2：crRNA合成

CRISPR RNA生物合成在转录之后，生成初级转录产物：pre-crRNA，之后经过加工，又成为一组短小的CRISPR 衍生RNAs（crRNAs），这些crRNAs每一个都包含有对应于之前遇到的外源DNA的对应序列。

CrRNAs导向序列两端是相邻重复序列区域，在I型和II型系统中，这种CRISPR转录产物会被CRISPR特异性核酸内切酶（Cas6 或 Cas5d）切割，切割位点位于重新序列。许多I型系统的重新序列会出现多次，因此Cas6也需要稳定连接在crRNA 3’端茎环上。对于III型系统来说，Cas6则是短暂连接，crRNA 3’端会进一步通过未知的酶处理。

II型系统中，CRISPR RNA加工过程则取决于反式作用 crRNA (tracrRNA)，tracrRNA包含一个重复序列的互补序列，这些双螺旋区域在Cas9出现时可以通过RNase III 进行处理。

相关论文解析：

CRISPR-mediated adaptive immune systems in bacteria and archaea.

这篇发表在Annu. Rev. Biochem. 杂志上的文章十分重要，解析了crRNA合成过程，以及其后的靶向干扰中的几个重要步骤，此后也被多人引用。

Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering

张锋的这篇综述概述了CRISPR/Cas9作为一种平台技术的开发状况以及在基因组编辑方面的应用，也讨论了其存在的一些挑战，以及未来的创新之路。

阶段3：靶向干扰

成熟的crRNAs能指导Cas蛋白靶向互补靶标，靶标序列由Cas 核酸酶降解，但其靶标降解的机制存在差异。I型和II型系统都可以靶向包含PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。III型系统则不依赖于 PAM作为识别序列，而是通过导向序列延伸至crRNA信号5'handle的核苷酸进行识别（CRISPR位点包含与导向序列，5'handle互补的序列），并阻止靶向切割。

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Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage during Type III CRISPR-Cas Immunity

一些数据表明，当病毒入侵细菌细胞时，称作为III型CRISPR-Cas的这一机制会靶向病毒的DNA，阻止它利用细菌的机器来拷贝自身及感染更多的细菌。但另外的一些实验表明，III型CRISPR-Cas只能通过切割病毒RNA来让病毒丧失能力。

洛克菲勒大学的研究人员他们检测了III型CRISPR-Cas对DNA和RNA的切割，结果发现了从前其他人没有得到过的一个关键成分，并发现CRISPR-Cas确实切割了病毒DNA生成的RNA，但它也切割了病毒的DNA。

这种双交叉系统有一些优势。许多的病毒整合到它们感染细胞的基因组中保持休眠状态，不会造成损伤。事实上，这些病毒对于细菌可能是有益的，例如它们携带的毒素帮助了细菌促进自身生存。举例说来，白喉毒素是由一种细菌所分泌，但编码这一毒素的基因却来自于一种病毒。只有在病毒开始将它们的DNA转录为RNA之时才会让它们丧失功能，通过设置这样的要求III型CRISPR-Cas不会损及休眠病毒，使得它们可以继续让宿主细菌受益。

循环关闭

I型系统中，监测复合物中靶向结合会导致Cas3介导的靶向降解（直接干扰）或zui初采集，这其中涉及crRNA导向募集Cas3、Cas1 和Cas2到外源DNA处，引起新一轮的快速采集。

II型系统中虽然未观察到zui初采集，但Cas9 也是protospacer筛选的必要元件，这表明在靶向干扰与外源DNA采集之间存在一种功能性。近期还有研究发现了编码anti-CRISPRs 蛋白的不同病毒基因，这也是指出了干扰以上不同阶段，能颠覆CRISPRs 系统。

Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR-Cas adaptation.

一些证据表明，某些Cas酶（未包括Cas9）自身可以操控记忆形成过程。基于Cas9识别切割位点的方式，研究人员猜测Cas9在记忆形成中也发挥了作用。

除了匹配CRISPR引导序列和病毒DNA，Cas9需要在附近寻找第二信号：病毒DNA中的前间区序列邻近基序( protospacer adjacent motif，PAM)序列。这是一个至关重要的步骤，因为PAM序列的存在阻止了Cas9攻击细菌自身包含记忆的DNA。

为了检验他们的假说，研究人员交换了化脓链球菌和嗜热链球菌免疫系统的Cas9酶，它们各自识别不同的PAM序列。结果，PAM序列跟随着在两种细菌之间发生了交换——表明在记忆形成中Cas9负责了PAM的识别。

Multiple mechanisms for CRISPR–Cas inhibition by anti-CRISPR proteins

研究人员确定了其中三种anti-CRISPR蛋白：AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能机制。他们对这些蛋白进行了生物化学及体内研究，证实每一个anti-CRISPR蛋白都通过不同的机制来抑制了CRISPR–Cas的活性。有两个anti-CRISPR阻断了CRISPR–Cas复合物的DNA结合活性，但它们是通过与不同的蛋白质亚基互作，利用了空间或非空间抑制模式来做到这一点的。第三种anti-CRISPR蛋白通过结合Cas3解螺旋酶-核酸酶，阻止其招募到结合DNA的CRISPR–Cas复合物上来起作用。在体内，这一anti-CRISPR可以将CRISPR–Cas系统转变为转录遏制物，证实了一种蛋白质相互作用蛋白可以调控CRISPR–Cas活性。作者们认为，这些anti-CRISPR蛋白质不同的序列及作用机制表明了独立的进化，并预示了还存在其他的方式——蛋白质借助于它们改变了CRISPR–Cas的功能。

新研究探讨了蛋白质抑制CRISPR–Cas系统的机制。这些多样且不同的机制反映了病毒-宿主军备竞赛深层的进化根源。这些已知和尚有待发现的Anti-CRISPR，将为认识和操控CRISPR–Cas系统提供大量有价值的工具。其中一个例子就是，新研究发现AcrF3通过阻止招募Cas3将CRISPR–Cas系统转变为了一个基因调控因子。由于除了破坏外源DNA，CRISPR–Cas系统来执行着各种功能，许多重要的功能有可能是由与CRISPR–Cas元件互作，由此改变了这一系统活性的蛋白质来完成。