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细胞传代准备工作News

细胞传代准备工作
发布时间:2017-06-06 点击次数:848次

细胞传代准备工作
3.1.1细胞传代所需培养液及试剂需提前放置于生物安全柜内预热至室温备用。
3.1.2细胞传代材料,滴管、移液管、培养器皿、计数板、橡皮乳头。
3.2细胞传代步骤
3.2.1人无菌室之前用肥皂洗手,用75%酒精擦拭消毒双手。
3.2.2细胞传代前先在倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数观察。
3.2.3打开超净工作台的紫外灯照射台面30 min左右,关闭超净工作台的紫外灯,打开抽风机清洁空气,除去臭氧。
3.2.4超净工作台面应整洁,用75%酒精溶液擦净。
3.2.5贴壁细胞的传代
3.2.5.1贴壁细胞用滴管或移液管吸去培养器皿中的旧培养液。
3.2.5.2酌情可用2~3 mL 0.02%EDTA溶液洗去残留的旧培养基。
3.2.5.3以25ml培养瓶为例,向瓶内加入1ml消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面。
3.2.5.4在倒置显微镜下观察,当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后,应立即终至消化。
3.2.5.5吸除或倒掉消化液,加入少量的含血清的新鲜培养液,终至消化。
3.2.5.6用弯头滴管,吸取瓶内培养液,反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散,形成细胞悬液。
3.2.5.7计数,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液(7~10ml/大瓶,3~5 mL/小瓶)制成细胞悬液,然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖,适度拧紧后再稍回转,以利于CO2气体的进入,将培养瓶放回CO2培养箱。
3.2.6半悬浮细胞及悬浮细胞培养的传代
3.2.6.1半悬浮细胞先用滴管将细胞轻轻吹下来,把细胞悬浮液加入离心管离心(800~1000rpm, 5min),倒掉上清液。
3.2.6.2把细胞沉淀制成悬液,计数,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。
3.2.6.3悬浮细胞直接用滴管或移液管吸入离心管离心(800~1000rpm, 5min),倒掉上清液。
3.2.6.4把细胞沉淀制成悬液,计数,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。
3.2.6.5将培养器皿放回CO2培养箱培养(培养瓶培养需将瓶盖旋开半圈)。
3.2.6.6操作完毕,填写“细胞培养传代记录”。
3.3注意事项
3.3.1传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。
3.3.2每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满,折光性好,生长致密时即可传代。
3.2.4细胞培养传代吹打要轻柔不用用力过猛同时尽可能不要出现泡沫,这些都对细胞有损伤。
 

 


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