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非洲马瘟病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

非洲马瘟病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒是群中等小的双股 DNA 病毒,根据其理化性质分 α、β、γ、未分类疱疹病毒四个亚科。疱疹病毒感染的宿主范围广泛,可感染人类和其他脊椎动物。在自然界广泛存在,主要侵犯外胚层发育而成的组织,例如:皮肤、粘膜和神经组织。

  • 产品型号:50次
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2020-07-21
  • 访  问  量:408
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详细介绍
品牌其他品牌货号XY-0034
规格50T供货周期一周
主要用途荧光定量PCR具有更高的扩增效率、更高的扩增灵敏度、更高的扩增特异性。应用领域医疗卫生,环保,化工,生物产业,农业

非洲马瘟病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

African Horse Sickness Virus(AHSV)

产品及特点

非洲马瘟病毒(African Horse Sickness Virus,AHSV)会引起非洲马瘟,是 一种马属动物的急性或亚急性传染病,该病以发热、皮下结缔组织与肺水肿以及 内脏出血为特征,只能通过昆虫传播。马对此病的易感性,病死率高达 95%。 本病发生有明显的季节性和地域性,多见于温热潮湿季节,常呈地方流行或暴发 流行,传播迅速,因此灵敏快捷的诊断产品具有重要的意义。本公司产品开发非 洲马瘟病毒染料法荧光定量 RT-PCR 试剂盒,它具有下列特点:

1. 一站式,用于不需要单独准备每种成分,包括引物和对照。

2. 根据非洲马瘟病毒的保守基因序列设计的引物,具有良好的特异性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 检测,灵敏度比常规 RT-PCR 高 10-100 倍,可以达 到至少 1000 拷贝/反应。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技术,RT 和 PCR 两步在一个试管内完成,不需要中 间转移样品,降低了操作误差和可能的污染。

5. 本产品足够 50 次 30μL 体系的RT-PCR,只能用于科研,不能用于临床。

非洲马瘟病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒规格及成分

编号

成分

规格

试剂一

2×qRT-PCR 缓冲液

500 μL(棕色管) 

试剂二

10×qRT-PCR 酶混合液

100 μL(红盖)

试剂三

ROX 染料 I,50×

20 μL(棕色管)

试剂四

ROX 染料 II,50×

 20 μL(棕色管)

试剂五 荧光 PCR 模板稀释液  1mL(黄盖)

试剂六

非洲马瘟病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液

 100 μL(白盖)

试剂七 非洲马瘟病毒染料法 qRT-PCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) 50 μL(黄盖)
试剂八 天净沙核酸释放剂(试用装) 20 次(1mL,绿盖)
试剂九 使用手册 1 份

运输及保存 低温运输,-20℃保存,保存期限为 12 个月。阳性对照需要因易污染其他成分需 要单独放置。本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供 DNA 段作为阳性对照。

自备试剂 样品 DNA。

使用方法 一、稀释阳性对照(以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非 常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行)。为增加产品稳定性和避免扩 散传染性病原。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。用带芯枪头分别加入 45 μL 荧 光 PCR 模板稀释液,用带芯枪头,下同)。

2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(本试剂盒提供),充分 震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

3. 换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。

4. 换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所 得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。重 复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。 二、样品 RNA 的制备

5. 如果有 N 个样品,必须设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳性 对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL 上步制备的阳性对照 梯度稀释液中的第 4 号(浓度为 1×10E4 拷贝/μL,10μL 相当于 1 万拷贝) 再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样,样品 体积多少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

6. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提 取试剂盒兼容。本试剂盒免费赠送 20 次免 RNA 提取的天净沙核酸释放剂试 用装,

三、设置 RT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

7. 如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用 于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照,6 个用于标准曲线。如 果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个 PCR 管,其中 N+2 个用 于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用 于 PCR 阳性对照(用第 4 号阳性对照稀释液做模板)。下面只描述定量分析 的步骤,定性分析只是把 6 个标曲反应缩减成 1 个,其余不变。

8. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照,阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后后加):

成分

N+2 个制备 所得样品

qRT-PCR 阴性对照

qRT-PCR 阳性 对照(2-7 管)

2×qRT-PCR 缓冲液

10μL

10μL

10μL

非洲马瘟病毒染料法 qRT-PCR 引物混合物

2 μL

2 μL

2 μL

 50×ROX (见注)0.4μL  0.4μL 0.4μL

样品制备所得 RNA 模板 (来于第 8 步)

 5.6μL

 

 

 稀释所得 6 个阳性对照 (来于第 6 步)    各 5.6μL(2 号样到 2 号 管,3 号样到 3 号管…)
超纯水  5.6μL 
 10×qRT-PCR 酶混合液 2μL 2μL 2μL

4. 上机进行 RT-PCR,RT-PCR 反应参数为:2μL

过程

温度

时间

RT(逆转录)

50℃

15-30 min

预变性 95℃ 5 min

 

qRT - PCR 反应 (40 个循环)

95℃ 

15 sec

58℃ 

1 min(采集 FAM 通道的荧光信号)

 按仪器预设程序进行溶解曲线分析

四、数据处理

10. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值 为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

11. 如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于 或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于 或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等 于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大 于或等于 40 则为阴性,如果小于 40,则为阳性。

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