不会感受态细胞制备的 看过来啦

1.什么是感受态细胞

（1）感受态细胞其实是一种暂时性改变一下细胞膜的通透性，以利于外源DNA（如质粒）进入细胞。这样的活细胞称为感受态细胞。

（2）主要原理其实就是通过特殊的方法处理使细胞，使细胞膜的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源DNA（如重组质粒或者运载体）进入感受态的细胞。

2.
感受态细胞制备原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法，CaC12等化学试剂法)处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

常见的感受态细胞的制备方法一般有：化学制备法和物理制备法

3.化学制备法大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法)，该法先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌ACaC12的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中,重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到

5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子(Mn2+、Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。

化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70C保存，因此被广泛用于外源基因的转化。

4.物理制备法电转法（原理待续除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受）5.感受态细胞制备具体步骤1. 从 37 ℃ 培养 16～20 h 的平板中挑取一个单菌落（直径 2～3 mm），转到一个含有 100 ml LB 或 SOB 培养基的 1L 烧瓶中。于 37℃ 剧烈振摇培养 3 h。一般经验，1 OD600 约含有大肠杆菌 DH5α 109个/mL。

2. 将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置 10 min，使培养物冷却至 0℃。

3. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 特头（或与之相当的转头）以 4 100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。

4. 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后的痕量培养液流尽。

5. 每 50 ml 初始培养液用 30 ml 预冷的 0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2）重悬每份细胞沉淀。

6. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 转头（或与之相当的转头）以 4 100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。

7. 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使最后的痕量培养液流尽。

8. 每 50 ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2（或 TFB） 重悬每份细胞沉淀。

9. 此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70 ℃。

6.感受态细胞制备及转化的影响因素（1）、细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20°C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。密度过高或不足均会使转化率下降。

此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

(2)、质粒DNA的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。

对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

(3)、试剂的质量

所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4°C。

(4)、防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

(5)、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。