单克隆抗体制备技术

单克隆抗体制备技术

单克隆抗体制备技术

单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop)

 *章:  小鼠免疫

 第二章:  细胞融合

 第三章:  细胞建株

 第四章:  细胞株鉴定

 第五章:  腹水制备

 第六章:  抗体纯化和鉴定（略）

*章.                      小鼠免疫(BALB/c)

   小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备单抗的*保证。

一.小鼠免疫分两程方案:根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下:

1.短程免疫方案:

   *次:   1d   100ug(可溶性Ag)+等体积*佐剂.   腹腔注射. 0.4ml/只

   第二次:   7d   100ug+等体积不*佐剂           腹腔注射. 0.4ml/只

   第三次:   12d   50ug                                 IV   0.3ml/只

(强化)第四次: 15d   20ug                                 IV   0.3ml/只

     第17 d~24d内融合

     2长程免疫方案:

   *次:   1d    100ug+等体积*佐剂           腹腔注射(IP)0.4ml/只

   第二次:  14d    100ug+等体积不*佐剂           IP      0.4ml/只

   第三次:  21d    100ug                            IP或IV 0.4ml/只                      

   第四次:  25d     50ug                              IV    0.3ml/只

(强化)第五次: 28d    20ug                              IV    0.3ml/只

 第30d~37d内融合.

 注意:a.在融合前(即加强免疫前)必须测定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必须≥1:8000,长程免疫≥1:32000,方可做融合.b.免疫周期完成后所有小鼠需在一周内做完融合. 否则不能保证融合质量。                                                                             二． 小鼠免疫质控标准

1．免疫鼠血清滴度   短程≥1：8000，长程≥1：32000；                   

2．小鼠免疫后需在一周内做完融合；

3．免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。

免疫鼠选择：免疫种类为:baleb/c小鼠；性别.雌性佳：大小：6-7周龄：体重：20g;

健壮.活泼。

                     第二章．细胞融合

一．  融合前准备

1．  脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏，并制成单个脾细胞悬液，每只鼠的脾细胞约1～3亿。在制备过程中严格保证无菌。制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。

2．  SP2/0细胞准备：SP2/0细胞在融合前4天腹苏.并用8- Ag筛选两次，隔天换液，在融合前一天换成普通培养基1640,10%小牛血清，SP2/0细胞数量在2000万～3500万为宜，细胞处于分裂期较佳，衰老细胞不宜使用。

3．  PEG1450准备：取PEG1450干粉高压后加入等体积 PBS在60℃溶解即可使用，一次融合取0.8ml 50% PEG1450.

4．  HAT培养基准备：根据铺板数量准备，20%小牛血清的HAT1640培养基.20ml/块板。

5．  终止液15-20ml:不含 Hepes的1640培养基或PBS（PH7.4）

二. 融合:

制备脾细胞悬液并用PBS(PH9.4)洗涤干净后混入SP2/0细胞按脾细胞比SP2/0=10:1～5:2混合并离心,1200rpm×５min 离心后滴干混合细胞.轻敲弹松细胞团块。在37℃水浴中加入PEG1450  0.8ml在50秒内加完　不宜吹打，加完后在37℃水浴中反应2min后加入终止液在 5min内加完15～20ml,加终止液时应沿管壁缓慢加入.动作应轻柔.不宜吹打以免使刚融合的细胞分离。

三. 融合后加样:

融合细胞终止后于900rpm×8min离心，并吸干以防残留PEG。离心后把融合细胞转入HAT培养基，并滴板200ul/孔，全过程应防止吹散融合细胞。

四. 换液:

待融合细胞在HAT中培养7天左右后（即未融合的SP2/0和脾细胞死后）换成HT培养基。200ul/孔 第8～10天检测。

                  第三章．细胞建株

 一.融合板检测：

       待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测（检测方法参见附表ELISA方法）在ELISA质控合格（即阴性对照<1.0，阳性对照>1.0）后挑选阳性孔（一般OD450≥0.5）作亚克隆。

 二.亚克隆方法及检测:

      挑出融合板阳性孔全部细胞加入8-10ml HT培养基，混均铺板4-6纵行；待亚克隆生长5-7天，克隆长大（约1万个细胞以上/孔），即可检测（用 ELISA方法）。

三.单克隆铺板和检测:

     挑取亚克隆检测阳性值高的孔计数作有限稀释4:2:1:0.5个细胞四个梯度铺板1个阳性细胞株/块。待单克隆生长7-10天，单克隆细胞长至中等大小（1万/孔）时进行检测，其中单克隆细胞≥8个/株（一般检测12个孔），待检测单克隆全阳后再进行一次同样的单克隆。

四．细胞株确立：

      待两次单克隆检测全阳后挑出三孔/株，作扩大培养于24孔板；24孔板细胞长满后作交叉Ag鉴定和稳定性鉴定（即再次测其培养上清看是否还能分泌单抗）鉴定合格后选择其中一株长势好.OD450箱高的扩大培养于细胞瓶，并进行冻存，5支/株，≥200万/支细胞。

                   第四章．细胞株鉴定

   在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定。

鉴定标准：1.复苏活细胞数≥100万个细胞/支；

            2.活细胞中有活力细胞≥50万/株;

            3.复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细           菌.真菌.支原体等)出现.

            4.复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计 数铺板.并检测单克隆的分泌抗体能力是否是否全阳或有抗体分泌.

            5.细胞培养上清也需作ELISA确定是否分泌抗体同时作交叉抗原复查,及 western-boltting鉴定是否为单抗。

  第五章．腹水制备及细胞株扩增

腹水制备：在细胞株鉴定合格后收集培养瓶中细胞，打小鼠腹水方法如下：

1. 小鼠选择：10周龄  baleb/c雌性小鼠，小鼠毛发油光，活泼约30克体重。

2. 打腹水前小鼠准备：选优鼠在打腹水前，7—30天内致敏小鼠选石蜡油（或其它矿物油）0.5ml/只IP(腹腔)注射。

3. 打腹水：收集合格杂交瘤细胞加于PBS（PH值7.4）或生理盐水(无菌)中,200万-500万/只鼠。IP

4. 腹水收集：杂交瘤细胞注入小鼠腹腔后5-7天即可产生腹水。（小鼠状态：腹部篷隆，小鼠精神萎靡，不思饮）此时可用无菌注射器抽取约2-5ml/只。腹水特点：血性或乳白色或微黄、脂性、略浓。一般隔天抽取一次，每只小鼠抽取三次即可处死。）

腹水保存：抽取腹水后置4℃过。离心500rpm×10min.取上清短期存放于4℃(3-7天)，中期1-2月放于-20℃，长期6月者存放于-80℃。