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免疫组化染色过程中存在的问题News

免疫组化染色过程中存在的问题
发布时间:2017-04-25 点击次数:688次

免疫组化染色过程中存在的问题

良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环 节,每一个步骤或环节都可能影响到染色的zui终结果,因此,要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一 件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组 化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题,但从染色的结果看,一般可分为两类:无色片(即 无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。 一、 无色片 染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象,出现这种现象,有两种可能: 1、真阴性结果:整个染色过程没有出现问题,组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果: 即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况:(1)、切片中根本就不包含所预期检查的组 织或细胞。出现这种情况,要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了,要麽是技术员选错了蜡块。获得 正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明:制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事, 病理医生也起着*的作用。(2)、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如,组织未进行抗原修 复,有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达;或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织 的抗体;或一抗失效,虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程,但偶尔也遇到突然失效的情况,抗体长 期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节,如忘记加二抗或三抗,或 用了两次二抗而缺少了三抗,或配制 DAB 时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误,有一种简单的方法: 在三抗孵育结束时,将切片上的三抗甩在一张白纸上,在将配制好的 DAB 滴一滴在白纸的三抗上,观察是 否出现棕色。如果出现了,证明三抗和 DAB 的配制过程没有错误。如果这种 DAB 再滴到切片上没有出现 任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应,问题肯定在三抗 DAB 或 DAB 的配 制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单,就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达,说明染色的全过程 和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没有相应的抗原表 达。反之,如果阳性对照没有着色,表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻 找原因。阳性对照包括两种,一种称为“自身对照”或“内部对照”,这是指在测试的切片中本身就存在 已知的抗原,如正常淋巴结中存在 T 和 B 细胞抗原,CD20或 CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想 的对照,对照和测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比 性。在选择自身对照片时选择既有病变组织同时又有正常组织的部分,这样有利于对比。另一种称为 “外部对照”,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,需要用 HMB45或 Mart-1来检测,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提 示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题。因此, 应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要 设立外部对照的情况很多,如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大。为了解决这个问题, 目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起,制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等, 其连续切片储备待用,需要时取出一张便可作为阳性对照。另外,比较简单的方法,是采用阑尾作为阳性 对照,因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多,如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神 、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。 设立阳性对照是病理医生的任务或责任,而不是技术员的责任。病理医生观察了 HE 切片,了解切片中 是否有自身对照,如果没有,就应告诉技术员采用阳性对照。因此,病理医生在免疫组化中的作用是不可 忽视的。 抗体未覆盖上测试组织:当多块散开的小组织染色时,可能漏掉某块组织染色。 二、“杂音”染色片 免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色,这些非正常的着色称为“杂音” 染色。“杂音”染色种类繁多,产生的原因也多种多样,为了便于说明,笔者将其归纳为下面几种 1、 全片着色 全片着色是指整个切片全都染上了颜色,着色的强度可深可浅,总之,分不清那些组织是阳性那些组织是 阴性。出现这种现象的原因有: (1) 抗体浓度过高:一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是,每次使用新抗体前应当对其工 作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,既使是即用型的抗体也应如 此,不能只简单的按说明书进行染色。 (2) 抗体孵育时间过长或温度较高:解决办法是,严格执行操作规程,随身佩带报时表或报时 钟,及时提醒,避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的 时间不是传统的1小时,而是30分钟,因此,要根据染色结果进行调整。 (3) DAB 变质和显色时间太长:DAB 现用现配,如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的 DAB 不应存放时间太长,因为在没有酶的情况下,过氧化氢也会游离出氧原子与 DAB 产生反应而降低 DAB 的 效力,未用完的 DAB 存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB 的显色在显微镜 下监控,达到理想的染色程度时立即终止反应。不过当染色片太多时或用染色机时,这样做似乎不现实, 但至少应对一些新的或少用的抗体显色时进行监控,避免显色时间过长。 (4) 组织变干:修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等 都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细,采用 DAKO 笔或 PAP Pen 在组织周围画圈,可 以有效的避免液体流失,也能提高操作速度。 (5) 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于24小时):原因上不清楚,但现象存在。有的实验 室喜欢前一天将切片脱蜡至修复,第二天加抗体进行免疫组化染色,如果将装有切片和修复液的容器放在 4ºC 冰箱过夜,对结果无明显影响,如果放在室温,特别是炎热的夏天,会出现背景着色,因此, 不可存放时间太长。 (6) 一抗变质、质量差的多克隆抗体:注意抗体的有效期,过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新 买的抗体时设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。 2、 切片边缘着色 切片边缘着色也是一种常见的现象,这种现象称为边缘效应。产生的原因: (1) 组织边缘与玻片粘贴不牢,边缘组织松脱漂浮在液体中,每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致。 解决办法:制备的胶片(APES 或多聚赖氨酸),切出尽量薄的组织切片,不厚于4微米,组织的前期处 理应规范,尽量避免选用坏死较多的组织。 (2) 切片上滴加的试剂未充分覆盖组织,边缘的试剂容易首先变干,浓度较中心组织高而致染色深。解 决办法:试剂要充分覆盖组织,应超出组织边缘2 mm。用 DAKO 笔画圈时,为了避免油剂的影响,画圈应 距组织边缘3-4 mm。 3、“阴阳脸”着色 指组织一半着色一半无着色,形成交界清晰或不甚清晰的两种染色结果。其成因是试剂仅覆盖了部分 组织而不是全部。如加试剂后未让试剂流散开而集中在部分组织上。通常应该在加完试剂后,仔细看一遍, 是否有的组织未被试剂完全覆盖,如有这种情况,建议用牙签而不是用吸头或试剂瓶口将试剂引流开使之 将组织全部覆盖。另外,染片盒不平,切片倾斜,虽然开始试剂已全部覆盖了组织,但后来试剂流向一边, 部分组织未被试剂覆盖。对于这种问题,只要留心或想到了很容易发现,也很容易解决。有时,用 DAKO (或 PAP)笔在组织周围画圈时,划线太靠近或画到了组织上,由于笔油的力学原理,试剂不能达到靠近 划线附近的组织。还有气泡也可引起阴阳分明的着色,只是不着色区域是圆形,由于气泡中含气,试剂被 推到周围,因此,气泡中心的组织不着色。解决办法是滴加试剂时手法要轻,有气泡时用牙签捅破。 4、 灶片状着色 切片中着色区东一块西一块,呈灶片状分布,出现这种问题的原因有: (1) 裱片时水未排尽,在局部形成气泡使组织突起,染色时试剂渗入后不易洗尽,显色过深所致。解决 办法是,漂片盒里的气泡应去尽,晾片热台不能平放,应有45度左右的斜度,利于水流走和蒸发。 (2) 坏死组织灶,组织坏死后细胞破坏、酶的释放、蛋白游离、分解,复杂的肽链残段(如 Fc 段)可能 与一抗或/和二抗结合导致zui终着色。解决办法是在选择染色切片时应避免选择坏死组织较多的切片。 (3) 制作 APES 胶片时,胶的浓度太高,干燥后在玻片上留下白色小点,显色时白色小点着色。解决办 法是按照标准的制备方法进行,即5%盐酸酒精(5ml 盐酸+95%酒精95ml)浸泡玻片4小时、热水冲洗玻片 1小时、蒸馏水洗玻片1分钟、丙酮浸泡玻片5秒钟后空气干燥(室温)、2%APES(2 ml APES+98 ml 丙酮) 浸泡玻片5分钟、玻片过一下丙酮(1-2秒钟)、玻片过一下蒸馏水(1-2秒钟)、37°C 过夜干燥、室温储存 备用。如果制片过程中,因丙酮逐渐挥发而胶变浓时可适当加入一些丙酮。 5、 间质着色 着色部位主要在间质,间质着色的原因很多,如抗体与组织中的蛋白质因蛋白疏水基团相互作用形成非特 异性的连接而着色,加一抗前的血清封闭这一步就是为了避免非特异型的结合。又如血清中的免疫球蛋白 常常渗出到组织间质,很容易与抗体结合,造成间质着色,特别是 lambda 和 kappa 染色时。当甲状腺胶 质外溢到组织间质时,做甲状腺球蛋白染色也会出现间质着色。抗体不纯或抗体被污染也可出现间质着色, 我们曾遇到 CD20抗体不纯,除了染上 B 细胞外还染上了间质。 6、 细胞浆着色 胞浆着色是所有“杂音”染色中有欺骗性的着色,着色区局限在细胞内,间质无着色,看上去与 真实的免疫反应着色几乎一样,很难区别。胞浆里含有较多的蛋白质,因此,很多非特异性的染色除了见 于间质也可以出现在胞浆中。这种原因造成的着色,可以通过血清封闭解决。还有因内源酶造成的着色, 如血红蛋白(红细胞)、肌红蛋白(肌细胞)、细胞色素(粒细胞、单核细胞)、过氧化氢酶(肝、肾),这 些可用过氧化氢进行封闭。巨噬细胞吞噬各种抗原物质或 Fc 片断而出现胞浆着色,这种着色不易避免,但 可以通过形态学辨认出巨噬细胞而引起重视。内源性生物素的着色有欺骗性,因为它广泛的存在于组 织细胞中,我们研究结果显示:冰冻组织中存在内源性生物素,经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭, 加热抗原修复后造成内源性生物素暴露,内源性生物素暴露的强度在不同的组织有所不同,从弱阳性(+) 到强阳性(+++),内源性生物素在组织中的分布形式,既有散在分布也有弥漫分布,主要以颗粒状形式存 在于胞浆中,内源性生物素广泛存在于上皮源性组织,特别是腺上皮组织,亦存在部分非上皮组织,内源 性生物素不仅存在人体组织也存在大鼠组织,内源性生物素暴露的强弱与修复液有关,其强度增加依次为: 柠檬酸、EDTA、EGTA,热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭,非生物素检测系统 Polymer 两 步法(EliVision、EnVision)可避免生物素干扰。 7、 细胞核着色 不适当的组织处理可以出现细胞核着色,如组织在二甲苯里浸泡时间太长(如从星期五浸泡到下星期 一)、缓冲液中浸泡时间太长、组织变干、微波修复液的 pH 值和修复时间不当或修复过程中修复液留下得 太少,未没过组织等。解决办法是严格按照操作常规进行工作。


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