ChIP实验技术总结

Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)实验技术总结

ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcriptionfactor,TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

原理：活细胞状态下固定蛋白质/DNA复合物—超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段—抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体—特异性富集与目的蛋白结合的DNA片段—对目的片断进行纯化与检测—获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

对于刚接触ChIP实验的同学，丁香园lorry_zgf师兄的实力技术总结肯定会让您豁然开朗！

一：细胞篇

细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到75％-80％比较好。

二：抗体篇

抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体。单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

三：交联与超声破碎篇

交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH-3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能*不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范围也是可以接受的。

四：操作篇

尽可能的保持低温（4度）。沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其*沉降。说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，能够连续做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

五：解交联篇

说明书上说4小时已经足够，但建议解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

六：DNA片段的回收篇

样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在zui终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。