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ChIP实验技术总结News

ChIP实验技术总结
发布时间:2017-07-07 点击次数:1114次

Chromatin Immunoprecipitation(ChIP)实验技术总结

ChIP是一项比较流行的研究转录因子(transcriptionfactor,TF)与启动子(promoter)相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法,所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。当用甲醛处理时,相互靠近的蛋白与蛋白,蛋白与核酸(DNA或RNA)之间会产生共价键。细胞内,当TF与Promoter相互结合(生物意义上的结合)时,它们必然靠的比较近,或者契合在一起,这个时候用甲醛处理,能使它们之间产生共价键。

原理:活细胞状态下固定蛋白质/DNA复合物超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体特异性富集与目的蛋白结合的DNA片段对目的片断进行纯化与检测获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

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对于刚接触ChIP实验的同学,丁香园lorry_zgf师兄的实力技术总结肯定会让您豁然开朗!

一:细胞篇

细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络,也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到75%-80%比较好。

二:抗体篇

抗体是实验成败的致命因素之一!必须是IP级别的抗体。单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强,背景低。但是单抗有一个致命的弱点,就是识别位点单一,而在ChIP甲醛交联的过程中,很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭,导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题,但是多抗特异性较差,背景可能会偏高。一般而言,如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域),选择多抗比较稳妥一些。

三:交联与超声破碎篇

交联的程度会影响到超声破碎的效果,交联的程度越高,超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分,只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合,富集得到的Promoter的量不高,实验假阴性。交联过充分,基因组上结合了太多的蛋白,对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。一般来讲,按照我的经验,交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系,交联的条件也不一样。例如:NIH-3T3的交联条件是室温(25摄氏度)下15min,1%的甲醛浓度,而别的细胞系则可能*不一样。而超声破碎的条件,机器不一样,条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器,那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般,理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范围也是可以接受的。

四:操作篇

尽可能的保持低温(4度)。沉淀的时候可以先在4度放置一会,等它自然沉降一些,再超低转速(500rpm等)离心使其*沉降。说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方,能够连续做完,直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

五:解交联篇

说明书上说4小时已经足够,但建议解交联过夜。因为在那样的环境里,DNA不会降解,过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

六:DNA片段的回收篇

样品中SDS样品较高,普通的PCR产物回收试剂盒回收,很有可能会在zui终的样品中混入SDS,影响PCR实验结果。小Tip:过柱前,在样品中加入一定量的异丙醇,能有效的消除SDS沉淀。


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