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多种细胞的培养方法News

多种细胞的培养方法
发布时间:2017-07-18 点击次数:989次

多种细胞的培养方法

HePG2细胞和L-02细胞的传代:
HePG2细胞属人肝肿瘤的恒生细胞株,L-02细胞则是人胎肝细胞株,二者所使用的培养基可以是一样的,即zui常见的DMEM。一干使用低糖的。
细胞长满培养瓶时既要传代。使用胰酶消化即可。用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。使用前37度预热,细胞经PBS清洗两遍后,每个中号培养瓶加0.7ml的胰酶,胰酶的量可根据自己培养瓶的大小而定,原则就是能够盖满瓶底。加入胰酶以后,为使酶的活性zui大,将培养瓶盖拧紧后放回培养箱中,3分钟左右即用含血清的培养基终止消化。如果在室温情况下消化,时间相应加长,可以在显微镜下观察,当细胞界限已十分清楚,即已分离为单个细胞,且有少量细胞漂起,则要终止消化了。
16HBE细胞株的传代方法:
镜下观察细胞生长融合达70-80%,准备传代。常规开紫外照射超净台20分钟,同时把含10%胎牛血清的MEM培养基、0。25%胰酶、PBS放置37度培养箱中孵育。20分钟后开始传代。先弃掉旧培养液,加PBS洗一次,然后加0。25%胰酶2ml消化(指25乘25cm大小的培养瓶)细胞,镜下观察细胞,细胞突起回缩,细胞变圆,然后将培养瓶放置37度二氧化碳培养箱中孵育3分钟左右(当然时间是随机的,比如:新配的胰酶作用时间短一些,配制时间长的胰酶作用时间会长一些,当然要不断地镜下观察),待细胞大部分消化下来(大部分细胞呈流沙状脱离瓶壁),加4ml含10%胎牛血清的MEM培养基终止消化。反复吹打瓶壁上残留的细胞,并将已消化下来的细胞吹打均匀,然后吸入离心管中1000转离心1分钟,然后弃掉上清,用手指将离心管中的细胞弹打均匀,加新培养基,吹打均匀,分至3个新的培养瓶中,补足培养液。将培养瓶平放,小心移入37度二氧化碳培养箱中培养过夜。次日观察。

胃癌细胞AGS和SGC-7901的培养:细胞传代时不能长的太满,70%-80%就可以传了.实验前先把紫外灯打开照30分钟,然后再把鼓风机开10分钟,同时把培养液和胰酶放入37度水浴箱中,千万记住不要盖上水浴箱的盖子.传代时,我一般把培养瓶口过一下火,就直接把培养液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等细胞变圆,细胞间空隙加大就直接把培养液到去,不用离心,然后再吹打,虽说要轻柔,但很难吹打成单细胞悬液,所以稍用力也没有关系.虽然操作不规范,但节省时间,细胞也没有被污染.

AAV-293细胞的传代:
AAV-293细胞较喜欢成团生长,比较娇嫩,怕冷,传代时不要一次从二氧化碳培养箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出来传就可以了,否则细胞很容易死掉.细胞在50-60%传代,细胞生长状态.
用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶消化半分钟左右,弃去胰酶.观察培养瓶是否有针孔样缝隙,如有就可以加入培养液吹打细胞.消化过久,对细胞损害很大,而且成团很难吹打成单个细胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.轻轻放入二氧化碳培养箱中培养.



肺癌细胞(人类),其中绝大部分都是贴壁细胞,具体如:
(1) A549(肺腺癌)
(2) NCIH446(小肺细胞癌)
(3) 801(非小肺细胞癌)
(4) NCIH460 (大细胞肺癌)

在消化传代过程中,步骤基本一致:
吸去旧的培养液->用Hanks'(1X)清洗一两次->加入一定量的消化液(Trpsin-EDTA)->置显微镜下观察,待细胞大部分变圆时,回到超静台->吸去消化液->加入一定量的新培养液->反复吹打细胞->再置显微镜下观察,直到细胞全部悬浮起来->吸出一部分加入新的培养瓶中->zui后再补充加入一定量新的培养液(RPMI1640with 10% FBS).
注意: 吹细胞时尽量多吹边角儿,此处细胞生长的多.另外吸出细胞前要混匀.
另注:消化液的配制方法:
Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Na
prepared with 2.5g Trpsin(1:250) and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS
小鼠前脂肪细胞(3T3-L1):
吸弃原培养液-->PBS洗一两次-->加入400ul0.125%胰酶(原代加0.05% EDTA)消化-->转动培养盘,保证整个盘面都被trypsin液润过->吸弃trypsin后37度消化3min-->以完全培液(DMEM+10% FCS+1/1000Biotin+1/1000泛酸钙-->吸打(枪的吸力调至zui小),1:10接种,前后左右摇晃培养盘,细胞均匀后放入培养箱继续培养(10%CO2 ,37度)

MDBK(牛肾细胞)类型:贴壁细胞
来源:购自武汉病毒所细胞保存中心
由四川农业大学动物生物技术中心繁殖保存
传代步骤:
弃去旧的生长液-->用无钙镁水(CMF)冲洗贴壁细胞数次(视细胞瓶的大小,3--5次)-->剩少许CMF,滴入 ATV 2--3滴-->摇匀细胞瓶中的液体,使ATV均匀的分布到瓶里的没个地方-->放入37度二氧化碳温箱中3--5min消化-->弃去ATV,加入生长液,拍打吸吹下细胞-->镜下观察-->分瓶-->作好记号,放入37度二氧化碳温箱生长
细胞特点:该细胞生长力强,而且快速一般24h就可以张到80%,48h不传就会变的很老,所以该细胞传时要勤点;我感觉MDBK还是很好传的,比以前我传的ST、Vero细胞等要好传一些,且不那么容易死亡,所以是我的一个比较好的选择!该细胞适合接种疱疹病毒(如:伪狂犬病毒)!

BHK-21:弃除旧的培养液后---用缓冲液冲洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化约两分钟左右可以看到细胞像沙子一样脱落-------赶紧倒掉胰酶加入含10%的牛血清培养液终止消化。但目前国内能找到的BHK-21细胞大部分都有支原体感染,如果是好的BHK-21细胞能做到1比20的分种率。
补充一点关于BHK-21的培养,先用少量胰酶冲洗一下,弃去,再用胰酶消化1min左右,效果会好一些

皮肤成纤维细胞和THP-1细胞:皮肤成纤维细胞是贴壁生长的。THP-1细胞是悬浮的。
由于我们实验室养细胞的时间也不是很长,所以也只能说说自己平时的操作了。
先说皮肤成纤维细胞。当细胞铺满瓶底,也就是细胞与细胞之间没有间隙时,就可以传代了。一般十天左右传一代。先吸弃旧培养液,用D-Hanks液洗两遍,再加入0.25%的胰酶,加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底,然后静置两分钟左右,是能在显微镜下观察,当细胞之间出现间隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。吸去胰酶,加入含血清培养液,摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。因为血清可以终止胰酶的消化。然后吹打瓶底各处使细胞脱落。再分瓶补加培养液。
THP-1细胞的传代就比较简单了。可以有两种传代方法。如果镜下观察细胞状态很好,没有其它杂质即细胞裂解物之类的,就可以采用直接传代法。传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。吸弃上层少量培养液约三分之一,将余下的培养液分成两瓶,再分别补加培养液即可。如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。如果细胞数目较多可以低速离心约600转离心六分钟,细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类的杂质。如果觉得细胞数目不多比较宝贵,那就提高转速可以1000转离心六分钟,这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。离心后去除上清液,加入新的培养液吹打浑匀即可分瓶传代了。
目前的方法就这些,希望对新手有所帮助

BHK-21的经验:
吸出培养基,吸得越干净越好,直接加入1ml胰酶(T-25瓶),放到37度培养箱消化。是否需要用hanks 或 pbs之类得缓冲洗细胞并不必要,我都没有洗,感觉应该洗一下更好,但也更麻烦并增加了污染得可能性。如果细胞长得太老,可以先加入1ml胰酶在细胞表面浸润一下就吸出来,然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前预热到37度。由于胰酶平时保存在4度,反复预热对胰酶的活性不好,我的经验是将胰酶进行分装,尽可能避免胰酶反复冷却加热。消化时间的选择要根据实际情况决定,BHK-21还是比较好消化的,5-15min应该足够了,消化时间太长对细胞不利。可以在显微镜下观察消化情况,必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散,消化结束后直接加入培养基即可,胰酶会被血亲灭活。一般在T-25瓶中留7-8ml培养基培养。在90%单层细胞时,1:4传代2天后可长满。如果使用的培养基偏碱先放在CO2培养箱中平衡。细胞生长中注意观察培养基颜色(加入酚红作指示剂),如出现偏黄表明细胞代谢产酸较多,此时如细胞未长满应更换部分或全部培养基以确保细胞状态不受影响。


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